转录组扫盲系列--转录组如何建库？
很多老师都做过转录组，但你对转录组了解吗？知其然，更要知其所以然，才能对数据结果理解更深入，从本期起，小编给大家详细介绍下转录组实验及分析过程，里面肯定有你不知道的知识，赶紧get下吧！今天先介绍转录组建库原理。
RNA提取
转录组测得mRNA，提取却是提取的总RNA，只有质量合格的RNA，才会用来建库，评判RNA质量的有总量、浓度、有无杂质、RNA完整度，RNA质量标准参见推文：什么是RIN值？
真核生物体中总RNA=（～90%）rRNA+ （1～2%）mRNA+（8～9%）其他RNA，对于真核生物，成熟的mRNA可通过 oligo dT磁珠富集mRNA来进行建库；而如果想研究lncRNA、全转录组或原核生物转录组，可以通过去除rRNA的方法进行建库。
真核转录组建库
经常有人问我建库是先反转录还是先打断，今天就给大家一个明确的答案，真核转录组建库是先打断，然后再反转录，建库流程如下：
1. mRNA富集：RNA检测合格后，首先用带有Oligo（dT）的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA；
2. 片段化：加入fragmentation buffer试剂将mRNA打断成短片段；
3. 反转录：以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA；
4. 末端修复：末端补齐，再纯化修复后的cDNA，cDNA3‘端加A（dA - tailing）；
5. 连接接头：每个接头都有一个6bp的index，也叫barcode，每个样品用不同index接头，这样即使将不同样品混在一同测序（混之前要归一化），也可以再根据index区分出来。
6. 片段选择和PCR富集：用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库用于测序。构建原理图如下：
原核转录组建库
原核生物( 包括病毒) 的mRNA 多是多顺反子，即可以有几个基因同时被转录成一个mRNA，共同使用一个启动调控区，而真核生物多是单顺反子，即一次只转录出一个基因；原核生物mRNA与真核不同，无5′端帽子结构和3′端聚腺苷酸尾巴；所以，原核转录组建库时不能像真核生物那样用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，只能用去核糖体试剂盒（Ribo-ZeroTM kit）去除rRNA来富集mRNA。去除rRNA后其余操作步骤基本就和真核生物转录组建库一样了。
总结
以上步骤结束后就建好库了，库里面主要是片段长度在300左右的短的cDNA片段，这些片段就是来自于富集出的mRNA，这些短的cDNA片段两端都有测序接头以及barcode，以此作为身份标签，测序后可以方便地划归哪个样品。
测序出的序列称作reads，那么reads是如何转化为基因表达量信息呢？reads组装成基因吗？reads又是怎么比对到参考基因上的呢？想起来可能很简单，实际上分析过程也很复杂，想了解分析过程请持续关注本网站更新！
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- 发表于 2021-04-26 19:02
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- 分类：转录组
