很多老师都做过转录组,但你对转录组了解吗?知其然,更要知其所以然,才能对数据结果理解更深入,从本期起,小编给大家详细介绍下转录组实验及分析过程,里面肯定有你不知道的知识,赶紧get下吧!今天先介绍转录组建库原理。
转录组测得mRNA,提取却是提取的总RNA,只有质量合格的RNA,才会用来建库,评判RNA质量的有总量、浓度、有无杂质、RNA完整度,RNA质量标准参见推文:什么是RIN值?
真核生物体中总RNA=(~90%)rRNA+ (1~2%)mRNA+(8~9%)其他RNA,对于真核生物,成熟的mRNA可通过 oligo dT磁珠富集mRNA来进行建库;而如果想研究lncRNA、全转录组或原核生物转录组,可以通过去除rRNA的方法进行建库。
经常有人问我建库是先反转录还是先打断,今天就给大家一个明确的答案,真核转录组建库是先打断,然后再反转录,建库流程如下:
1. mRNA富集:RNA检测合格后,首先用带有Oligo(dT)的磁珠,通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA;
2. 片段化:加入fragmentation buffer试剂将mRNA打断成短片段;
3. 反转录:以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA,然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA,随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA;
4. 末端修复:末端补齐,再纯化修复后的cDNA,cDNA3‘端加A(dA - tailing);
5. 连接接头:每个接头都有一个6bp的index,也叫barcode,每个样品用不同index接头,这样即使将不同样品混在一同测序(混之前要归一化),也可以再根据index区分出来。
6. 片段选择和PCR富集:用AMPure XP beads进行片段大小选择,最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库用于测序。构建原理图如下:
原核生物( 包括病毒) 的mRNA 多是多顺反子,即可以有几个基因同时被转录成一个mRNA,共同使用一个启动调控区,而真核生物多是单顺反子,即一次只转录出一个基因;原核生物mRNA与真核不同,无5′端帽子结构和3′端聚腺苷酸尾巴;所以,原核转录组建库时不能像真核生物那样用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,只能用去核糖体试剂盒(Ribo-ZeroTM kit)去除rRNA来富集mRNA。去除rRNA后其余操作步骤基本就和真核生物转录组建库一样了。
以上步骤结束后就建好库了,库里面主要是片段长度在300左右的短的cDNA片段,这些片段就是来自于富集出的mRNA,这些短的cDNA片段两端都有测序接头以及barcode,以此作为身份标签,测序后可以方便地划归哪个样品。
测序出的序列称作reads,那么reads是如何转化为基因表达量信息呢?reads组装成基因吗?reads又是怎么比对到参考基因上的呢?想起来可能很简单,实际上分析过程也很复杂,想了解分析过程请持续关注本网站更新!
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