转录组扫盲系列--转录组如何建库?

很多老师都做过转录组,但你对转录组了解吗?知其然,更要知其所以然,才能对数据结果理解更深入,从本期起,小编给大家详细介绍下转录组实验及分析过程,里面肯定有你不知道的知识,赶紧get下...

很多老师都做过转录组,但你对转录组了解吗?知其然,更要知其所以然,才能对数据结果理解更深入,从本期起,小编给大家详细介绍下转录组实验及分析过程,里面肯定有你不知道的知识,赶紧get下吧!今天先介绍转录组建库原理。

RNA提取

转录组测得mRNA,提取却是提取的总RNA,只有质量合格的RNA,才会用来建库,评判RNA质量的有总量、浓度、有无杂质、RNA完整度,RNA质量标准参见推文:什么是RIN值?

真核生物体中总RNA=(~90%)rRNA+ (1~2%)mRNA+(8~9%)其他RNA,对于真核生物,成熟的mRNA可通过 oligo dT磁珠富集mRNA来进行建库;而如果想研究lncRNA、全转录组或原核生物转录组,可以通过去除rRNA的方法进行建库。

attachments-2021-04-pF5V3bN260869cfdbf3da.jpg

真核转录组建库

经常有人问我建库是先反转录还是先打断,今天就给大家一个明确的答案,真核转录组建库是先打断,然后再反转录,建库流程如下:

attachments-2021-04-kaiL3fzu60869d45a84c5.jpg

1. mRNA富集:RNA检测合格后,首先用带有Oligo(dT)的磁珠,通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA;

2. 片段化:加入fragmentation buffer试剂将mRNA打断成短片段;

3. 反转录:以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA,然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA,随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA;

4. 末端修复:末端补齐,再纯化修复后的cDNA,cDNA3‘端加A(dA - tailing);

5. 连接接头:每个接头都有一个6bp的index,也叫barcode,每个样品用不同index接头,这样即使将不同样品混在一同测序(混之前要归一化),也可以再根据index区分出来。

6. 片段选择和PCR富集:用AMPure XP beads进行片段大小选择,最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库用于测序。构建原理图如下:

attachments-2021-04-umOauJmY60869d64f07e5.png

原核转录组建库

原核生物( 包括病毒) 的mRNA 多是多顺反子,即可以有几个基因同时被转录成一个mRNA,共同使用一个启动调控区,而真核生物多是单顺反子,即一次只转录出一个基因;原核生物mRNA与真核不同,无5′端帽子结构和3′端聚腺苷酸尾巴;所以,原核转录组建库时不能像真核生物那样用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,只能用去核糖体试剂盒(Ribo-ZeroTM kit)去除rRNA来富集mRNA。去除rRNA后其余操作步骤基本就和真核生物转录组建库一样了。

attachments-2021-04-EaINZ7s860869d8c3860e.jpg

总结

以上步骤结束后就建好库了,库里面主要是片段长度在300左右的短的cDNA片段,这些片段就是来自于富集出的mRNA,这些短的cDNA片段两端都有测序接头以及barcode,以此作为身份标签,测序后可以方便地划归哪个样品。

测序出的序列称作reads,那么reads是如何转化为基因表达量信息呢?reads组装成基因吗?reads又是怎么比对到参考基因上的呢?想起来可能很简单,实际上分析过程也很复杂,想了解分析过程请持续关注本网站更新!

1. 文章越来越难发?是你没发现新思路,基因家族分析发2-4分文章简单快速,又能发文章,又能学生信技能,一举两得的SCI好思路;基因家族分析课程已更新分析内容,最新版课程学习链接基因家族分析实操课程

2. 转录组数据结果理解不深入?图表看不懂?这就是你转录组数据不会挖掘、文章不会撰写的原因,让我带你一起深入了解转录组数据结果,学习链接:转录组(有参)结果解读转录组(无参)结果解读

3. 转录组数据深入挖掘技能-WGCNA,提升你的文章档次,学习链接:WGCNA-加权基因共表达网络分析

4. 转录组数据怎么挖掘?多学点数据处理技能:学习链接:转录组标准分析后的数据挖掘

5.微生物多样性分析很简单,但是分析内容项目并不少,理解起来有困难?看我深入浅出讲给你听,学习链接: 微生物16S/ITS/18S分析原理及结果解读

6. 学生物的必学生信技能:Docker安装与使用linux系统入门Perl语言入门到精通Python生信入门到精通perl语言高级编程

7. 生信绘图、科研绘图技能:Cytoscape与网络图绘制微生物OTU网络图绘制(CytoscapeR语言基础与绘图R语言绘图基础(ggplot2)

8.生物信息实战技能,0基础也可以学会,内含脚本及demo数据:RNAseq有参转录组自主分析基因组重测序自主分析、微生物多样性自主分析

9. 更多学习内容:linux、perl、R语言画图,更多免费课程请扫描下方二维码进入组学大讲堂网校学习:

attachments-2018-11-eEmO1t6q5c01489ecbc34.jpg

  • 发表于 2021-04-26 19:02
  • 阅读 ( 49 )
  • 分类:转录组

0 条评论

请先 登录 后评论
红橙子
红橙子

61 篇文章

作家榜 »

  1. omicsgene 419 文章
  2. 安生水 226 文章
  3. Daitoue 167 文章
  4. 生物女学霸 120 文章
  5. CORNERSTONE 72 文章
  6. 红橙子 61 文章
  7. 生信老顽童 48 文章
  8. landy 37 文章