转录组扫盲系列--reads如何比对到参考基因组上?

上一期给大家介绍了转录组建库原理:转录组扫盲系列--转录组如何建库?建完库下一步就是测序,测序原理讲起来其实很复杂,但是我觉得测序过程少了解一点对于理解转录组数据影响不是很大,下面有...

上一期给大家介绍了转录组建库原理:转录组扫盲系列--转录组如何建库?建完库下一步就是测序,测序原理讲起来其实很复杂,但是我觉得测序过程少了解一点对于理解转录组数据影响不是很大,下面有个视频,大家可以了解一下小小的测序芯片方寸之地的波澜壮阔的工程之美:illumina测序原理-组学生物翻译(点此链接观看)。

数据下机后就是数据分析,在整个分析流程中我觉得最重要的步骤就是reads比对参考基因组,了解比对过程对于了解转录组的大有裨益!今天我就给大家介绍下reads是如何比对到参考基因组的。

什么是插入片段?reads?

前面建库原理部分我们讲过受制于测序技术的原因,基因需要先随机打断成300bp左右的小片段然后再反转录,这些反转录好的300bp左右的cDNA称为插入片段(Insert Fragment),如下图:两端深蓝色部分是测序接头(adapter),中间淡蓝色是要测序的插入片段,插入片段长度(Insert size)指的就是这个浅蓝色部分的长度。

目前的高通量测序仪是双端测序,也就是分别从插入片段两端进行测序,每一端读取的ATCG序列称为一条reads,每条插入片段都会产生2条reads,即reads1和reads2,一个样品对应的reads1和reads2数据是分为2个压缩包存放的,我们也把这些未过滤的reads称为原始数据(raw data),过滤掉接头及低质量的reads后的数据称为clean data。

attachments-2021-04-5B6taz9z60869f646e4ca.jpg

有参转录组reads比对参考基因组

参考基因组是指该物种已经破译的全基因组序列信息及注释文件,reads比对到参考基因组是数据分析的第一步,也是最重要的一步,其他所有分析内容都是基于reads比对结果分析的,如下图:

attachments-2021-04-1sPBxy0060869f86390e9.png

那么,reads比对是你所想的那样,根据序列互补直接比到参考基因上吗?事实上,reads比对没那么简单,应为真核生物的基因组结构复杂,外显子、内含子交替排列,并不是所有的reads只会比对到一个结构上,甚至有很多reads是横跨内含子的,这样的话怎么能比对上去呢!

那么,现实转录组项目里是如何比对的呢?以软件Tophat2为例,reads比对有3个过程:

1. reads比对到转录组

假如参考基因组注释信息是完整的,Tophat2就会先将reads比对到该参考基因组提取出的转录本序列上,这就大大提高了比对的准确性,还可以避免序列比对到假基因上。

2. reads比对到基因组

上一步没有完全比对到转录组的read会进一步通过Bowtie2软件比对到基因组序列,在这一步比对中,只有能够连续比对到单一外显子的reads将会映射到基因组上,而比对到多个外显子的read则不会映射到基因组上。

attachments-2021-04-fPWb73ak60869fa735283.png

3. 剪接比对

经上述2步未被映射上的read将会被片段化,通常默认大小为25bp,再次比对到基因组上,该步骤较为复杂,可总结为以下3个步骤,如下图,(a)寻找剪接位点:如果TopHat2发现reads片段化后的左右两个片段位于用户定义的最大内含子区长度范围内,TopHat2就会将read映射到整个基因组的区域以便于去寻找那些含有剪接信号(GT-AG, GC-AG, or AT-AC))的剪接位点;(b)串联间隔序列:将步骤(a)中找到的潜在的剪接位点的侧翼基因组序列被串联起来,并构建索引,未映射的read片段用Bowtie2比再次比对串联的侧翼序列。(c)重新比对:被分割的片段重新连接形成完整的reads成整个reads的跨内含子比对。

attachments-2021-04-Dky553E860869fcb5c7a4.jpg

需要注意的是在步骤2 reads比对到基因组中会有一些reads会比对到内含子区域,此类reads将会用新的剪接位点的信息进行重新再比对一次。

无参转录组reads比对

无参物种没有可用的参考基因组,是如何进行reads比对的呢,如下图:我们可以看到与有参不同的是无参转录组需要先将reads拼接、组装成转录本,目前常用的组装软件是Trinity,该软件是由耶路撒冷希伯来大学和Broad研究所共同开发的一种针对无参考基因组RNA-Seq数据构建转录本的工具

对于某个基因Trinity可能会拼接出多个对应的转录本,一般会选取其中长度最长的转录本作为Unigene来代表该基因的转录本,把所有的unigene组成的序列集当做该物种的参考基因组,然后就可以进行reads比对了。

attachments-2021-04-zOXraaSn60869fff06931.jpg

reads比对中的几个关键概念

Mapped reads比对到参考基因组(无参物种是unigenes,下同)的reads,mapped reads并非严格要求100%比对,比对软件一般都会有一定的容错率,一般reads与参考基因组允许最大错配为2个碱基

Multiple mapped reads:比对到参考基因组多处位置的Reads数目。

Uniq Mapped reads:比对到参考基因组唯一位置的reads。

mapping rate比对到基因组的reads占clean reads的比值;比对率会随着亲缘关系、基因组组装质量、测序质量、有无污染等有所波动,一般mapping rate大于60%,再低的话就要考虑进行无参组装了。

BAM文件:reads比对到参考基因组后,会得到一个以sam或bam为扩展名的文件,而bam就是sam的二进制文件,也就是压缩格式的sam文件,里面存储了reads的比对信息,更多信息请参见:你了解SAM和BAM文件吗

好了,reads比对今天就介绍到这里,希望对您的学习有所帮助!下一期我会继续给大家分享如何利用reads计算基因的表达量,感兴趣的朋友请持续关注!

1. 文章越来越难发?是你没发现新思路,基因家族分析发2-4分文章简单快速,又能发文章,又能学生信技能,一举两得的SCI好思路;基因家族分析课程已更新分析内容,最新版课程学习链接基因家族分析实操课程

2. 转录组数据结果理解不深入?图表看不懂?这就是你转录组数据不会挖掘、文章不会撰写的原因,让我带你一起深入了解转录组数据结果,学习链接:转录组(有参)结果解读转录组(无参)结果解读

3. 转录组数据深入挖掘技能-WGCNA,提升你的文章档次,学习链接:WGCNA-加权基因共表达网络分析

4. 转录组数据怎么挖掘?多学点数据处理技能:学习链接:转录组标准分析后的数据挖掘

5.微生物多样性分析很简单,但是分析内容项目并不少,理解起来有困难?看我深入浅出讲给你听,学习链接: 微生物16S/ITS/18S分析原理及结果解读

6. 学生物的必学生信技能:Docker安装与使用linux系统入门Perl语言入门到精通Python生信入门到精通perl语言高级编程

7. 生信绘图、科研绘图技能:Cytoscape与网络图绘制微生物OTU网络图绘制(CytoscapeR语言基础与绘图R语言绘图基础(ggplot2)

8.生物信息实战技能,0基础也可以学会,内含脚本及demo数据:RNAseq有参转录组自主分析基因组重测序自主分析、微生物多样性自主分析

9. 更多学习内容:linux、perl、R语言画图,更多免费课程请扫描下方二维码进入组学大讲堂网校学习:

attachments-2018-11-eEmO1t6q5c01489ecbc34.jpg


  • 发表于 2021-04-26 19:13
  • 阅读 ( 1639 )
  • 分类:转录组

你可能感兴趣的文章

相关问题

0 条评论

请先 登录 后评论
红橙子
红橙子

66 篇文章

作家榜 »

  1. omicsgene 482 文章
  2. 安生水 235 文章
  3. Daitoue 167 文章
  4. 生物女学霸 120 文章
  5. CORNERSTONE 72 文章
  6. 红橙子 66 文章
  7. 生信老顽童 48 文章
  8. landy 37 文章