前言

土壤酸化对农作物产量的影响巨大，然而，由于人类活动及其他的环境问题，导致全球范围内30%以上的耕地出现不同程度的酸化现象。其中，铝（Al），即使是相当微量的浓度，在酸性土壤中也会明显抑制植物根系的生长，造成农作物减产。

不过，有研究发现，也有一些耐Al性非常高的植物，茶树（Camellia sinensis L.O. Kuntze）就是其中的一个典型代表。下面就来介绍一篇利用RNA-seq研究茶树Al耐受性机理的文章，告诉大家它的成长真不容易！

预实验确定RNA-seq取样点

分别在0、100、200、400、1000 μM Al浓度下进行茶树苗水培，测定根部生长的相关指标，确定哪一种处理下，茶树苗生长最佳。

结果表明，200 μM Al处理下，茶树苗的根系生长最佳，包括侧根生长等。1000 μM高浓度处理，茶树苗生长明显受到抑制（上图）。因此，取200 μM（作为CK组）、0 μM（空白组）、1000 μM（高Al浓度组）处理的茶树苗根，每组三个重复，进行RNA-seq。

RNA-seq基本结果

测序数据经过处理，共获得316,200 transcripts，213,699 unigenes，平均长度分别为758 bp和565 bp。

针对所有的unigenes进行注释分析，包括常见的Nr、Nt、GO、KOG、KEGG等数据库。其中GO和KEGG注释结果如下图：

其中KEGG注释涉及五大类（图标ABCDE)，结果显示metabolism过程(D)注释到的基因数量最多（20014），其次是organismal systems (E,13925)和genetic information (C,9452)。说明代谢相关的通路在Al响应的过程中可能被激活，参与了相关的生理过程。并且metabolism 过程可以细分为更多的代谢相关通路。

差异表达分析与GO富集

基于基因的表达量进行差异表达分析,三组两两比较，高浓度与空白处理（Null vs High）获得的DEGs数量最多，一共1333 DEGs（下图），高浓度与对照(High vs CK)相比，共获得743 DEGs，而空白处理和对（Nul lvs CK）相比仅87 DEGs。

针对差异基因进行了GO富集，结果如下图所示。High vs CK的DEGs富集到的GO term主要是生物过程和分子功能两大类，其中分子功能涉及的"metal ion binding"(金属离子binding),"cation binding"(阳离子binding)等几个GO term和Al处理响应可能相关。

Null vs High的DEGs富集到生物过程类的GO term主要涉及的是单体代谢、氧化还原以及金属离子转运，而分子功能类的主要是金属离子子binding和阳离子binding等。

而Null vs CK的20个上调DEGs主要涉及的是阳离子的转运和离子转运。

挖掘不同处理下重要的DEGs

处理浓度的差异，诱导基因的差异表达从而实现Al的响应过程。因此基于注释的结果，并结合前人研究的结论，重点分析了几类重要基因的差异表达情况。

其中一类是转录因子相关的基因。包括ERFs、bZIP等等，这些转录因子主要涉及的是发育和环境刺激，以及一些生物和非生物胁迫的信号转导。这些转录因子调控下游基因参与了植物的Al胁迫响应过程，并且其中大部分都在高浓度的Al处理下反而呈现高表达的趋势。

还有一类是转运体相关的基因，主要是涉及金属离子跨膜运输的转运体（MATE family)和ABC转运体等等。这些转运体可能和Al毒性解除有关，此类基因也出现明显差异表达。

此外还重点分析和植物激素等相关的DEGs，这些基因和信号传递关系紧密。

STOP1/ART1-regulated gene

基于前人的研究，重点讨论了其中一类锌指结构的转录因子——STOP1/ART1的调控基因，该转录因子在水稻和拟南芥与三价铝离子耐受性以及氢质子毒性紧密相关。

本研究中发现了两个同源的CsSTOP1基因出现轻微上调。而它们潜在的下游基因（受调控的基因）主要涉及的功能包括了细胞壁的维持、根的伸长、膜蛋白、代谢以及解毒等等，其中很大一部分在不同浓度处理下出现了非常明显的上调或者下调，包括PGIP1（多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白1）、Expansin-A（扩展蛋白A)、ALMT（铝激活苹果酸转运体）、CYP450（细胞色素氧化酶P450）等等。

qPCR验证

为验证RNA-seq结果的可靠性，选择了11个基因，利用qPCR进行验证实验，结果发现，所选的基因的表达趋势和RNA-seq结果基本一致，说明RNA-seq结果可靠。

结论

在不同的Al浓度处理下，茶树生长状况存在明显差异，RNA-seq发现涉及Al耐受性的相关基因存在差异表达，这些基因参与的调控作用对茶树在酸性土壤和较高的Al浓度下正常生长起到了重要作用。

参考文献

Yong L, Jie H, Song X, et al. An RNA-Seq transcriptome analysis revealing novel insights into aluminum tolerance and accumulation in tea plant[J]. Planta, 2017(13):1-13.