IF:8.8|TCGA+ceRNA+肝癌文献解析
ceRNA，中文名竞争性內源RNA。和ncRNA等概念不同，ceRNA并不是代表某种特定类型的RNA，而是一种调控机制，指生物体内复杂的转录调控网络中的RNA，主要包括蛋白编码基因mRNA、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、假基因（pseudogenes）等。
如上图：miRNA可通过抑制靶基因mRNA的翻译，或促进mRNA降解来起到负调控的作用；circRNA，能够像海绵一样吸附、结合miRNA，使其不能发挥负调控的作用，从而促进靶基因的表达；lncRNA可以与miRNA互作，作为ceRNA并吸附miRNA，抑制miRNA的作用，促进mRNA表达。在这个过程中miRNA和circRNA起到拮抗的作用：miRNA水平升高抑制靶基因表达，circRNA水平升高则促进靶基因表达。其中的几个主角：lncRNA 、 circRNA、miRNA、靶基因mRNA共同构成了ceRNA调控网络。一个靶基因可能被多个miRNA、circRNA/lncRNA同时调控，所以ceRNA调控网络可能非常的庞大。
解读文献
研究背景
肝细胞癌（HCC）是危害人类健康的最致命的恶性肿瘤之一。越来越多的证据强调竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络在各种人类癌症中的关键作用。然而，HCC中ceRNA网络的复杂性和行为特征仍不清楚。在这项研究中，旨在阐明磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）相关的ceRNA调节网络，并确定与HCC相关的潜在预后标志物
ceRNA网络构建分析流程
数据：TCGA数据库人类HCC表达谱数据以及临床信息（LIHC），表达数据包括lncRNA、mRNA以及miRNA；GEO基因表达谱-GSE410804作为验证数据集靶基因预测数据库：tarbase、targetscan、miRDB数据分析思路：1.样本按照两组分组类型（PTEN高表达/低表达、肿瘤组织/正常组织）分别进行差异表达分析，获得各自的差异mRNA、lncRNA以及miRNA。2.对两组差异lncRNA取交集，获得的lncRNA在tarbase数据库中预测下游miRNA；预测到的miRNA与差异miRNA取交集，获得的miRNA在miRDB、TargetScan数据库中预测靶mRNA；预测到的靶mRNA与差异mRNA取交集。3.最终获得的差异lncRNA、miRNA、mRNA以及他们之间的调控关系，通过Cytoscape构建ceRNA网络，并通过其中的Cytohubba插件进行分析筛选hub ceRNA网络。4.对所筛选得到的子网络进行相关性分析，km分析，细胞定位分析，根据分析结果进一步选择潜在的预后模型。
5.模型中的RNA结合临床特征进行单因素、多因素cox回归分析，从而获得具有独立预后效果的RNA。
6.探究具有独立预后效果的RNA与免疫浸润之间的关系，并通过富集分析来确定其在HCC中的潜在功能。
探究PTEN在HCC中的抑癌作用和预后价值
首先探讨PTEN在肝细胞癌中的作用，（A）通过人类蛋白质图谱数据库（HPA）发现PTEN在肝癌中低表达，在正常组织中过表达。（B）HPA的免疫组化染色结果也证实了相似的PTEN异常表达。（C）由于PTEN在肿瘤组织的异常低表达，研究了PTEN在肝细胞癌患者中表达的临床意义，绘制了km曲线，结果表明PTEN的异常低表达与患者生存率低显著相关。随后，为了解PTEN在肿瘤样本中异常低表达的潜在机制，（D）通过cBioPortal分析PTEN的基因组和拷贝数，结果显示TCGA HCC数据集中PTEN基因的缺失，（E）此外PTEN缺失的肝细胞癌组织的mRNA表达低于二倍体PTEN的肝细胞癌组织，（F）同时，PTEN拷贝数值与mRNA表达呈正相关。
鉴定差异mRNA、lncRNA、miRNA
根据以上分析结果，与PTEN相关的ceRNA网络可以作为预测肝细胞癌患者预后的潜在模型。
首先采用TCGA数据库鉴定具有PTEN高表达和PTEN低表达的HCC样本之间、以及HCC组织与癌旁组织之间的差异mRNA、lncRNA、miRNA。以p<0.05和|logFC|>0.5作为筛选差异lncRNA的阈值，以p<0.05和|logFC|>0.3作为筛选差异miRNA的阈值，以p<0.005和|logFC|>0.7/0.5作为筛选差异mRNA的阈值。筛选结果：PTEN高低表达之间差异mRNA-1871个（195上调、1676下调）、差异lncRNA-860个（137上调、723下调）、差异miRNA-54个（21上调、33下调）；HCC组织与癌旁组织之间差异mRNA-8294个（7059上调、1235下调）、差异lncRNA-3371个（3041上调、330下调）、差异miRNA-420个（102上调-318下调）
（A-C）火山图展示PTEN高低表达组之间差异mRNA、差异lncRNA、差异miRNA的分布。（D-F）热图展示15个显著的差异mRNA、差异lncRNA、差异miRNA
构建ceRNA网络
首先对PTEN高/低组之间的差异lncRNA以及癌症组织/正常组织之间的差异lncRNA取交集，根据这些交集lncRNA在TarBase数据库中，识别潜在的靶miRNA；预测到的miRNA与PTEN高/低组之间的差异miRNA以及癌症组织/正常组织之间的差异miRNA的交集miRNA取交集，筛选到4个miRNA；之后使用miRDB以及TargetScan数据库来预测这4个miRNA的下游mRNA，除此之外，为提高预测准确性，仅取两个数据库共同的预测结果。（A）结果显示，在差异mRNA中鉴定到了373个mRNA。最后共有5个lncRNA（4上调、1下调）、4个miRNA（1上调、3下调）、372mRNA用来构建ceRNA网络。之后采用Cytoscape来识别筛选ceRNA网络中的hub网络。（B）结果显示3个lncRNA（DLEU2L、FAM99A、ARRDC1-AS1）、4个miRNA（miR-99a-5p、miR-100-5p、miR-9-5p、miR-125b-5p）、以及6个mRNA（TAOK1、HS3ST3B1、RHOQ、BAZ2A、AGO2、NR6A1）被筛选出来。为了探索hub网络潜在的功能，利用Metascape进行功能富集分析（KEGG、GO），（C）结果显示网络中的mRNA被特异性富集在”蛋白质激酶活性“、”GTP结合酶“、”参与细胞分化的形态发生“
构建并验证核心ceRNA网络、筛选HCC预后模型
为了在HCC中建立具有良好预后价值的核心ceRNA网络，首先分析hub网络中RNA在PTEN高/低组以及癌症组织/正常组织中的表达水平。正如之前所提到的，PTEN高/低组中的RNA表达水平与癌症组织/正常组织相反。结果显示，在PTEN高/低组中，hub网络中RNA表达水平为：1个下调lncRNA（DLEU2L）和2个无差异lncRNA（ARRDC1-AS1、FAM99A)、一个上调miRNA（miR-9-5p）和三个下调miRNA（miR-99a-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p）、三个下调mRNA（TAOK1、HS3ST3B1、AGO2）和三个无差异mRNA（RHOQ、BAZ2A、NR6A1）；而在癌症组织/癌旁组织中，两个lncRNA（DLEU2L、ARRDC1-AS1）上调和一个lncRNA下调（FAM99A)、一个上调miRNA（miR-9-5p）和三个下调miRNA（miR-99a-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p）、五个上调mRNA（TAOK1、RHOQ、BAZ2A、NR6A1、AGO2）和一个下调mRNA（HS3ST3B1）
为了确定这些RNA与生存是否相关，使用KM分析对患者进行OS分析。发现一种lncRNA（DLEU2L）、两种miRNA（miR-99a-5p、miR-100-5p）和三种mRNA（TAOK1、HS3ST3B1、RHOQ）与预后相关。
除此之外，由于lncRNA的细胞定位决定潜在机制，通过lncLocator分析三种lncRNA的亚细胞定位。（A）DLEU2L主要分布在细胞质中，其他两个lncRNA分布在细胞质基质中。通过以上分析，可推测DLEU2L可能吸附miR-99a-5p/miR-100-5p来提高TAOK1的表达。（B）因此构建了DLEU2L-miR-99a-5p/miR-100-5p-TAOK1 ceRNA网络。（C）Tarbase和TargetScan预测DLEU2L和TAOK1的3端UTR中的靶位点分别与miR-99a-5p/miR-100-5p配对。（D）此外，表达相关性分析表明DLEU2L与TAOK1之间存在正相关性关系。
因此选择ceRNA网络中的DLEU2L/TAOK1轴作为潜在预后模型进行分析DLEU2L/TAOK1轴在HCC患者中的临床相关性
为了确定DLEU2L/TAOK1的表达水平是否和临床因素相关，对此进行相关性分析。通过单因素和多因素cox回归分析来确定生存相关特征。结果显示在单因素cox回归分析结果中DLEUL2与TAOK1过表达水平与较差预后显著相关，而在多因素cox回归分析中，DLEU2L表达与不良预后无关。因此，TAOK1可能为HCC患者的独立预后因素。TAOK1异常高表达验证
根据GEO数据库中的HCC患者样本中的TAOK1表达进行差异分析，结果显示TAOK1在HCC组织中的表达明显高于正常组织，这与TCGA数据得到的结果一致。TAOK1表达与免疫浸润的相关性
为了评估肿瘤免疫浸润水平与TAOK1表达之间的潜在关系，（A）使用TIMER分析不同免疫细胞中TAOK1的基因拷贝数。（B）分析TAOK1与免疫细胞浸润水平之间的相关性。（C）评估免疫浸润对患者预后的影响
- 发表于 2022-01-07 10:15
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- 分类：文献解读
