1.Summary

为保证下游分析输入数据的可靠性，需要对下机的原始测序数据进行质控。通常我们会使用FASTQC软件对测序数据进行质控。fastqC会生成一个html的结果报告，下面是软件对质控结果进行判断：绿色代表PASS；黄色代表WARN；红色代表FAIL（当出现黄色时说明需要查看结果）。

fastq文件了解,可观看课程:https://study.163.com/course/courseMain.htm?share=2&shareId=400000000234009&courseId=1005231058

2.Basic Statistics

Filename:文件名

File type: 文件类型

Encoding：测序平台的版本和相应的编码版本号

Total Sequences: total reads的数量

Sequence length: 测序长度

%GC: GC含量，表示整体序列的GC含量，由于二代测序GC偏好性高，且深度越高，GC含量会越高。

3.Per base sequence quality:碱基质量统计

所有reads碱基的测序质量统计结果。箱线图中红色线表示中位数，黄色是25%-75%区间，延伸线是10%-90%区间，蓝线是平均数曲线。若任一位置碱基的下四分位数低于10或中位数低于25，报"WARN"；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报"FAIL"。

4.Per tile sequence quality

流通池中不同芯片（tile）的碱基测序质量平均值对比，显示了测序仪的系统差错。热图中蓝色部分是质量较好的点，红色越明显则是测序质量越低。纵坐标为tile编号，如果某tile的测序质量很低，可以考虑去除该tile的序列数据。

5.Per sequence quality scores

每条read的碱基质量均值的统计结果。横轴为测序质量quality，纵轴是read数目。从图中可以容易得看出不同质量范围内的read数量。其中当峰值也即最大read质量小于27（错误率0.2%）时报"WARN"，当峰值小于20（错误率1%）时报"FAIL"。

6.Per base sequence content

对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基（正常情况）比例的分布情况。横轴为碱基位置，纵轴为百分比。正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresentedsequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias(建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"。

7.Per sequence GC content

统计reads的平均GC含量的分布。横轴为GC比例，纵轴为reads数量。红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresentedreads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"。

8.Per base N content

正常情况下N的比例是很小的，所以图上常常看到一条直线，但放大Y轴之后会发现还是有N的存在，这不算问题。当Y轴在0%-100%的范围内也能看到“凸起”时，说明测序系统出了问题。当任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；当任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"。

9.Sequence Length Distribution

统计reads长度的分布。横轴为片段长度，纵轴为read数量。当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报"FAIL"。

10.Sequence Duplication Levels

统计序列的重复度（duplication level，也即一个文库中某条序列的copy数），理论上大部分序列都只出现一次，低的重复度意味着高的基因组覆盖率。测序深度越高，越容易产生一定程度的重复，这是正常的现象；但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication）。可以想象，如果原始数据很大（事实往往如此），对所有序列的比较将会需要很大内存，所以FastQC只用前100,000条reads来进行统计，以反映全部数据中序列重复度情况。而且，大于75bp的reads只取前50bp进行比较，由于reads越长越不容易完全相同（由测序错误导致），所以这样做使得重复度的统计更加严格。序列duplication level分布图将会展示文库中不同重复度的序列所占比例，其中横坐标是duplication levels，纵坐标是duplicated reads的比例。图中蓝色线展示了全部序列中不同重复度序列的百分比，红线显示的是有重复序列中不同重复度序列的百分比（所有序列的重复度减去1）。

由于展示范围的限制，重复数目大于等于10的reads会被按照区间合并统计，造成在duplicationlevel为10的时候曲线突然凸起，结果如下所示：

当非unique（也即duplication level大于1）的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL"。

11.Overrepresented sequences

如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。FastQC的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样，为了计算方便，只取了fastq数据的前100,000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不全在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。统计结果以列表形式展示，当发现超过总reads数0.1%的reads时报"WARN"，当发现超过总reads数1%的reads时报"FAIL"。

12.Adapter Content

统计接头序列的含量。一般测序仪自带软件会切去接头序列，所以下机数据并没有接头序列。

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