细胞被污染补救措施大全!细菌真菌黑胶虫支原体一网打尽

最近,学霸姐姐的细胞总是处在要污染,已经污染,扔掉,复苏,再污染的死循环里面,细菌真菌轮番上演。

相信有这种烦恼的童鞋不止我一个人,所以,今天我们来探讨一下细胞的污染的问题。



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首先,要知道什么是细胞污染——凡是对细胞生长有危害的成分或者造成细胞不纯的异物都视为污染。细胞污染根据污染源可以分为化学污染,物理污染和生物污染。

一、化学污染

细胞培养所用到的培养基高压蒸汽锅灭菌。其中,血清作为细胞培养中常用的培养基,血清存在潜在的化学污染,此外血清成分具有不确定性,血清对不同细胞的生长影响包括毒副作用等存在差异。

二、物理污染

物理污染,主要指温度、振动、放射线、辐射等物理因素对细胞的破坏。如将细胞液培养基等暴露于放射线或紫外线下,会引起细胞代谢改变。

恒温培养箱的周围存在能够产生机械振动的设备,可能也会对细胞生长存在一定影响。

三、微生物污染(这一种才是我们经常遇到的)

细菌


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常见的污染之一,细菌污染常见的有大肠杆菌,葡萄球菌等。细菌污染较易发现,培养细胞受细菌污染后,会很快出现培养液变混浊,pH改变。也有少数培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。

如果你是在给自己养细胞,建议还是每天都看一下。

解决方法:

1)不管是什么污染,只要细胞污染,如果不是十分珍贵的细胞,丢弃,重新培养。

这里重新培养的时候要注意你自己的细胞是什么状态下污染的,如果是传代的时候污染的,就要看污染了多少盘,若全部污染,那么所有的东西重新换过,先排除试剂的原因,等你不再污染,你可以用原来的试剂试一下,

如果换了试剂还是污染,那就需要清扫孵箱和房间;如果是其中一盘污染,可能是你自己操作的原因,自己下次需要多多注意,

一般我们都是在需要用细胞的时候才会去养,很少是拿来练手的,所以污染的第一时刻就是保证接下来的细胞不要污染,等细胞养起来再慢慢找原因。

2)如果细胞是十分难得,珍贵的细胞,需要挽救的话,建议分别配置含10倍双抗的PBS和5倍双抗的完全培养基各一份。然后先用10倍双抗的PBS洗涤细胞5-10次,

然后用5倍双抗的完全培养洗涤细胞3次以上,并在其后每培养1小时换液一次,最后2倍双抗培养基培养过夜,第二天换成一倍双抗完全培养基继续培养,传代两次以上,如未发现污染,即可冻存,并留出部分细胞继续采用无双抗培养基培养48小时以上,最终确定细胞不含有任何污染物。

真菌:


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常见的污染之一,污染的多是曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌,梅雨季节更容易污染,现在我们进入了梅雨季节,真菌也如约而至。

真菌生长的相对比较慢,而且不会像细菌那样刚开始就对细胞生长产生很大的影响,刚开始污染如果只看细胞很可能就会忽略,但时间长之后,细胞的活力状态变差,培养液是清亮,不变色的,在其中可以看到白色或浅黄色漂浮物,镜下也有丝状物、管状、树枝状或卵形的物质,念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形,有时候可看到明显的菌丝。

解决方法:

1)因为霉菌有孢子的存在,所以酒精,新洁而灭,紫外线等等根本不可能去除霉菌!同上面第一个,不重要,立马处理掉。或与其它细胞隔开,同时所用的实验器材和试剂重新换过。

2)真菌最好可以做到预防,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

3)在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

4)孵箱应定期清洁(1月左右),尤其在多雨的季节。

5)预防霉菌污染,可在培养基里加3ul/ml的两性霉素或制霉菌素)或[放线菌素D或双抗。

6)最主要的还是要培养良好的无菌观念,避免培养基撒入培养箱以及生物安全柜,这些撒入培养箱的培养基为细菌及真菌的繁殖提供了很好的条件。

7)如果已经污染,把所有细胞从污染的CO2孵箱转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(全部,尤其四个角)。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。

8)将环境彻底消毒,整个培养间用福尔马林和高锰酸钾熏蒸,孵箱内部包括托盘等全部用苯酚搽洗,封闭2天。

9)细胞一旦污染,很难挽救,即使使用制霉菌素或放线菌素D,也是伤敌八千自损一万的办法,高浓度的抗霉菌素对细胞有毒性作用。

如果新发现污染的话,pbs多次冲洗细胞,尽量洗掉菌,然后用两性霉素25ug/ml处理12-24小时,换液后两性霉素换3-5ug/ml浓度,每天换液,连续处理2-3天,传代后分出一点接种到35mm培养皿中,不加两性霉素,观察有无霉菌继续生长,其余传代细胞继续加两性霉素,直至确保不加药的细胞无霉菌存活。

黑蛟虫:


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可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。

解决方法:

1)可以增加细胞的种板密度,以提高细胞的生存率。

2)使用Procell “黑胶虫”清除培养基

Procell 黑胶虫清除培养基经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证,对细胞无害,对清除“黑胶虫”污染效果显著,能够很好的杀灭和抑制“黑胶虫”,秒杀其它品牌的支原体培养基。

学霸姐姐使用Procell 黑胶虫清除培养基处理前后对比图:

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原虫:


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培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,最终形成恶性循环。

解决方法:

污染的可能原因很多,比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等,如果细胞很多的话,直接扔了重新复苏细胞,如果是保种细胞的话,可购买相关的灭菌试剂。

支原体:

介于细菌和病毒之间能独立生活的最小微生物。一般过滤除菌无法去除,光镜下难以看清结构。开始不易发现,能够在偏碱性条件下生存,对青霉素有抗药作用。支原体感染后,细胞生长变慢,部分细胞变圆脱落。

解决方法:procell支原体清除培养基

Procell支原体清除培养基是Procell含有清除“支原体”的特殊成分(一种混合制剂,可通过抑制DNA和支原体生长所必须的相关蛋白合成来取得良好的支原体清除效果,最大程度上挽救珍贵的细胞,减少因支原体污染带来的损失)。

学霸姐姐使用Procell 支原体清除培养基处理前后对比图:

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污染的可能原因:可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等,高师姐有支原体的预防和检测,大家可以看一下。

常规预防污染:

1,在培养基中加入双抗,预防用量就可以了,10ul/ml。但双抗会影响细胞的状态,所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗,以避免影响实验结果。

2,孵箱应定期消毒或者紫外光照射,并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱,孵箱内的水最好是三蒸水

3,超净台取材器材培养液培养瓶操作都要按照规定拿取和操作,不要随心操作,快速频繁地走来走去。

4,超净台的风机不能过大,风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染

5,无菌室经甲醛熏蒸消毒后,可用同等量的氨水喷洒中和,约几小时即可进入操作。

6,操作者个人原因:这个是最可以预防的,在使用器械和溶液前一定要检查是否可用,是否过期,如果过期不要抱侥幸心理,一定要重新灭菌或者正规处理,尤其有时候不带口罩、手套而且操作时还大声说话是最不应该的。

最后,学霸姐姐想说:

细胞污染,预防才是硬道理!!!不要想着有补救办法,两败俱伤的办法并不是好办法,最重要的是预防!预防!预防!!!

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生物女学霸,一个自称学霸其实很渣的生物汪,
努力将有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事儿呈现给大家,
关注一个好不啦~
  • 发表于 2019-05-06 15:48
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