细胞培养步骤梳理:细胞复苏、传代、冻存中的细节问题

我们就从细胞的衣食住行到传宗接代为大家逐一介绍,细胞培养时中常遇到的那些不可忽视的问题,及我们到底该如何解决

养细胞这件事儿,看似简单,然而却常常因为各种原因,让我们珍贵的实验细胞一再受损或者死亡,今天小编就结合多年实践经验和细胞培养指南,为大家讲述细胞从复苏、传代到冻存等一系列过程及常遇到的那些你可能忽略的小却重要的细节。

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一、细胞的营养来源

针对大多数肿瘤细胞,营养配方一般为:90%合成培养基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);为了防止污染,可以加1%双抗!

常见问题解答:

Q:针对不同细胞,细胞培养基配方一样吗?如何获知呢?

A:不同细胞的培养基是不同的。一般ATCC购买的细胞,针对不同细胞株,会有详细介绍,包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源乳腺癌细胞MCF-7细胞一般为1640,人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基。

Q:培养基为什么一般都是偏红色?

A:因为培养基加了酚红来显示颜色,指示pH范围为6-8,颜色会由黄变为紫红。这是为了我们能更直观观察培养液的变化,如变黄,则代表偏酸,偏碱性了就显示偏紫色。一般来说,细胞吸收营养后,变黄后就暗示我们要换培养基啦!所以密切观察很重要哦!

Q:大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长,那可以替换吗?

A:不建议更换ATCC指定的培养基,因为当培养基改变时,细胞的性质可能也会变化。

Q:若是细胞生长缓慢,是否可以增加血清比例?

A:可以!

二、细胞的居住环境

舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。如下图为培养细胞的器皿,包括形状、规格、用途多样的培养瓶、培养皿及培养板。最终住进37℃,5%CO2的恒温培养箱。

常见问题解答:

Q:细胞培养板规格不一,如何正确选用?

A:根据不同规格的细胞培养皿/板容量及用途,如流式一般用 6 孔,爬片一般用 24 孔,MTT 一般用 96 孔等,具体信息如下图所示:

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Q:细胞培养皿和培养瓶区别?

A:就细胞培养状态来说,培养瓶和培养皿没有太大区别,主要在于安全系数(培养瓶>培养皿)、培养细胞数量(大培养瓶>培养皿)。但是培养瓶成本也会相对较高,因此无特殊要求,一般选择培养皿即可。

三、细胞的复苏与冻存(原则是慢冻速融)

1. 细胞复苏:指将冻存的细胞解冻之后重新培养,细胞恢复生长的过程。

复苏过程如下图所示:

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常见问题解答:

Q:为什么细胞复苏后,很多难以贴壁?

A:忽略培养基的问题,主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快,可不时摇动冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。

Q:为什么细胞贴壁了,却长不起来?

A:此时需要考虑的是细胞密度问题,一些细胞倾向于维持一定的密度,若复苏的细胞生长缓慢,可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。

2. 细胞冻存 将细胞放在低温环境(-70℃~-196℃),细胞内的代谢降低,可最大限度的保存细胞活力,以便长期储存。

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常见问题解答:

Q:目前细胞冻存液多采用的什么配方?

A:目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂,细胞冻存液的配方有很多种,如培养基:血清:DMSO=7:2:1或8:1:1或5:4:1,或直接用血清:DMSO=9:1,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,复苏存活率在80%~90%以上。

Q:若没有细胞冻存盒,我们该怎么办?

A:可先将冻存管放入4℃冰箱中10min,再移至-20℃冰箱30min,-80℃冰箱2h或过夜,最后放入液氮罐内。为了节约时间,还可直接在冻存盒外包裹一团棉花,用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点,将细胞转移至-80℃冰箱过夜,再转移至液氮保存。

Q:细胞冻存时对细胞量有要求吗?

A:细胞复苏时会有一定的细胞死亡,因此细胞的浓度应足够高,起始浓度106—107个/ml/管;

四、细胞的传代培养

细胞传代:细胞在培养过程中不断增殖,培养皿/瓶空间有限,当细胞接触过密,生长就会受到抑制,影响细胞状态,因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。

常见问题解答:

Q:为什么我们总说选择对数期细胞传代?

A:如下图:细胞的生长和分裂,一般遵循以下模式:停滞期,对数期(指数期),平稳期(平台期)和衰退期。为了确保活力,遗传稳定性和表型稳定,必须使细胞保持在对数期。

Q:那如何确定细胞对数期?

A:根据上述细胞生长曲线,为了确保活力,必须使细胞保持在对数期就传代,所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。

Q:一般细胞传代都是1分2吗?

A:要根据不同细胞而定,如有的生长很快,比如说4T1细胞,传代取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又特别慢,比如 BT474。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。

Q:消化很关键吗?

A:不得不说,细胞状态差,很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同,因此对胰酶的反应也不同,我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止;而非细胞全部分散成单个。如下图分别是正确和错误的消化时间:

Q:部分比较难消化的细胞怎么办?

A:可放于37℃培养箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受细胞为例,放于37℃培养箱消化5-8min,轻轻拍打,才见细胞成片移动,因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。

Q:几天换培养基?

A:正常情况下,培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5~6.6条件下,培养基变黄,说明培养液中代谢产物已堆积到一定量,细胞会脱落死亡,需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1~2天换一次,生长缓慢时,3~4天亦可。针对复苏后的细胞,建议隔天换液。

Q:每天观察细胞有必要吗?

A:一般的肿瘤细胞我们是隔天传代,但是切不可忽略对细胞的观察,一定要每天都要去看一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住,是每天。

Q:如果细胞形态不清晰或有异物等,如何处理?

A:可以考虑如下操作:首先,倒掉旧的培养基,用新的培养基或者PBS洗涤2-3次,再开始正式的消化、吹打。其次,把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。

Q:细胞污染怎么办?

A:如发现细胞有污染,一般建议丢弃。如果细胞非常宝贵,可试着加入含抗生素的培养基反复清洗,并用抗生素含量高的培养基培养,并经常更换培养基;

学霸姐姐就介绍到这里了,细胞培养是后续实验的基石,看似简单的传代却有着大学问,希望大家在实践操作中,可以结合我们为大家提供的小细节,多多联系和摸索,相信你的细胞会养的更加漂亮!

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生物女学霸,一个自称学霸其实很渣的生物汪
努力将有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事儿呈现给大家
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  • 发表于 2019-04-30 15:28
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  • 分类:实验相关

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