iTRAQ/TMT蛋白质组学分析基本知识点

iTRAQ和TMT的区别?蛋白质组学分析依赖参考基因组么?分组混标原则?

蛋白质组(Proteome)一词源于蛋白质(protein)与 基因组(genome)两个词的组合,意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。

蛋白质组与转录组有许多相似之处,也具有时空特异性,会随着环境、组织或个体的改变而改变。

蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢、生长发育以及各种胁迫反应等过程的整体而全面的认识。

iTRAQ和TMT的结构与区别

iTRAQ和TMT是近年来应用最广泛的差异蛋白质组学技术,它们均采用体外标记的方法,利用同位素试剂标记蛋白质酶解后产生的多肽,对两个或多个样本,在全蛋白质组层面上展开相对定量分析。

说到这里,很多人可能会认为iTRAQ和TMT是两种不同的定量技术,其实二者只是不同厂家生产的(iTRAQ是AB SCIEX研发,TMT是Thermo Fisher研发),在标记规格(iTRAQ是4标和8标的;TMT是2标、6标以及10标的)、标签分子结构上有些许差异,其他原理基本一样。

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Questions and Answers

1、iTRAQ/TMT与Label free相比有什么优势?

Label free无需同位素标记,不受样本条件的限制,定性没有问题,但是定量的准确性不高,会受到质谱重复性等因素的影响。

iTRAQ/TMT的覆盖度高、灵敏度高、重复性好。但是在混标上机时要充分考虑样品的情况,样品数量较多时,实验设计会较为复杂。

2、做iTRAQ/TMT蛋白质组学分析,不同老师的样本可否放在一组上机?

不同老师的样品或者同一个老师不同实验的样品,都不能放在一组上机。不同的物种的样品,在搜库的时候选择的数据库不一样,无法进行搜库比较。同一个物种的不同处理的样品,经过不同实验室处理后,样品里的蛋白种类和丰度会有较大差别,混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定。

3、蛋白质组学相关的文章中,选择的差异倍数经常有1.2倍、1.3倍、1.5倍、2倍等待的,这有没有一个统一的标准?

目前蛋白组学分析大多数是按照差异倍数2倍或1.5倍进行分析的,但是我们要根据实际情况,对差异倍数做出合适的调整,这样才能得到最佳的结果。在文章发表当中,没有谁规定差异倍数必须是多少。我们做分析的时候要学会灵活处理,不要墨守成规!

4、iTRAQ/TMT定量蛋白质组做完实验后,能拿到什么结果呢?

可以拿到差异蛋白、差异蛋白的GO、KEGG、COG等数据库的注释信息和富集信息、差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作分析等结果。如果有其他实验数据,比如转录组测序结果,那么可以做转录组和蛋白质组学的联合分析,找出差异蛋白和差异基因的相互作用关系等。

5、所研究的物种没有全基因组序列,能否做蛋白质组学分析呢?

没有参考基因组的物种也可以做蛋白质组学分析,一般我们会先看其近缘物种有没有参考基因组,如果有的话,可以考虑使用。或者我们对所测样品做一个转录组测序,使用转录组构建一个简易的蛋白库作为数据库使用。如果二者都没有的话,那就不建议做了,结果会非常不准确的。

6、在做转录组和蛋白质组联合分析时,为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白?

由于转录和翻译是两个不同的生物学过程,引起基因差异表达和蛋白差异的原因有很多,比如非编码RNA的调控、蛋白的降解、蛋白的分泌等等。所以差异基因和差异蛋白不可能完全一致,根据经验,其相关性也就50%不到。

7、蛋白质组学分析也要求重复么?生物学重复or技术重复?几次重复?

生物重复是必须的,一般来说至少3次生物学重复。技术重复可以不做,当然做了更好,会增加实验的严谨性。

8、如果样品数量较多,不同批次之间的误差怎么进行校正?

由于itraq或tmt技术上的限制,最多标记10个样品,所以,当样品数超过10个的时候就需要设置内参,以矫正不同批次之间的批次差异。

比如:做18个样品,则需要做成两组10标的进行上机,每组9个样品加1个内参(内参是多个样品的混样或标准品),总共需要做的样品数就是9+9+1+1=20个。

9、原核生物比如细菌能够做蛋白质组学分析么?

iTRAQ/TMT适合任意来源的总蛋白样本,植物、动物、细菌、真菌等。在分析上原核和真核生物没有明显的区别。

10、组学生物的蛋白质组学分析有什么优势?

实验方面,我们的机时更长,做到18个馏分;标准分析方面,我们在不断更新,尽量做到国内最全;后期个性化分析速度快,质量好,没有大公司的拖延症。

以上即是小编为大家汇总的一些iTRAQ/TMT蛋白质组学分析方面的知识点和问题解答,希望对各位朋友有所帮助。

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