免疫共沉淀CoIP实验过程步骤详解,so easy !!

想知道你的目的蛋白质是否与另一种蛋白质交织在一起? 最简单、最经典的方法——你可以使用免疫共沉淀 (Co-IP)来实现。

免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

92410865de7248d79227de0e95b6d607.png

当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在琼脂糖凝珠(argarose beads)上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过western blotting或质谱对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。

实验流程:

免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。

实验步骤详解:

一、细胞总裂解液的制备

① 转染后24h收集细胞,1400r X 3min,4°C离心,弃去上层培养基

② 冰上静置裂解细胞,加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀,冰上静置10-15min。注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂,通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml)

③ 12000 x 5-10min, 4°C离心

④ 将离心后的上清液转移至新的EP管内,每管转移的量保持一致,注意不要吸到底部沉淀,全程冰上操作

f4156566dc8c4c99aff184f4a6cfa880.png

二、免疫共沉淀

① 留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min,作为input组

② 提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内,要使用剪去了尖头的枪头吸取beads,且保证每管里的beads量一致,小心吸去上清液,加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体

③ 4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶,准备下一步Western blotting)

④ Binding结束,1400r x 1min, 4°C离心

⑤ 真空泵或移液枪吸去上清,注意不要吸到沉淀,加入800ul NETN,上下颠倒混匀,保证底部的沉淀悬浮起来

⑥ 离心,重复4)5),洗beads三次

⑦ 最后一次弃去上清,用点样枪头将残液吸净,加15ul 2xloading buffer煮5min,作为Co-IP组点样,剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次,作为IP组点样。

三、Western blotting检测

① 点样顺序通常按照Co-IP组、Input1、Marker、IP组、Input2,跑胶。

② 转膜,封闭后Co-IP组、Input1加入蛋白B的抗体,IP组、Input2加入蛋白A的抗体4°C进行孵育。

③ 回收一抗,室温孵二抗。

④ 显影,观察实验结果。

注意事项:

1. 细胞裂解要采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质与蛋白质的相互作用,多采用非离子去垢剂(NP40 或Triton X-100),不能用高浓度的去垢剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,通常Leupeptin和Aprotinin这两种即可,若蛋白较大,可加胰蛋白酶抑制剂(PMSF),若涉及到磷酸化信号转导,要加磷酸化抑制剂(如Na3VO4)。同时全程冰上操作。

2. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

3. 使用对照抗体如小鼠的IgG,可以排除非特异性结合的情况,若存在假阳性结果和非特异性蛋白,可尝试降低抗体浓度,或更换特异性高的抗体。

4. 若没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或信号太弱,可尝试降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类;选择亲和性更高的抗体或者过表达以提高目的蛋白的含量;若是目的蛋白受亚细胞定位的影响,则需重新选择裂解液配方以释放目的蛋白。

没时间做实验也想发论文?推荐——巴菲尔免疫共沉淀实验技术服务

巴菲尔生物提供整套的免疫共沉淀实验技术服务,只需要您提供相应的组织样本/细胞样本,巴菲尔生物将提供对应的诱饵WB实验结果及免疫共沉淀WB/质谱检测结果,并且保留原始的实验曝光胶片以及免疫共沉淀实验报告。

可以说非常严谨了,学霸姐姐力荐,谁用谁知道!

学霸姐姐只能帮你到这样了,剩下的就靠你自己了......

3881f7d775614577a4a4813d14a249fe.png

生物女学霸,一个自称学霸其实很渣的生物汪,
努力将有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事儿呈现给大家,
关注一个好不啦 
  • 发表于 2019-05-09 15:50
  • 阅读 ( 3216 )
  • 分类:实验相关

你可能感兴趣的文章

相关问题

0 条评论

请先 登录 后评论
生物女学霸
生物女学霸

生物专业

120 篇文章

作家榜 »

  1. omicsgene 319 文章
  2. 安生水 216 文章
  3. Daitoue 167 文章
  4. 生物女学霸 120 文章
  5. CORNERSTONE 72 文章
  6. 红橙子 47 文章
  7. 生信老顽童 43 文章
  8. landy 37 文章