转录组个性化分析之可变剪切分析工具:rMATS turbo

转录组个性化分析之可变剪切分析工具:rMATS turbo

可变剪接(Alternative splicing):一个基因的外显子以不同的组合方式剪接形成不同的成熟RNA,从而被翻译成不同的蛋白质构体,因此,一个基因可能编码多种蛋白质。这个过程极大的增加了mRNA和蛋白质的多样性。可变剪切是一种后转录生物学过程,对细胞活动和疾病过程具有重要的且广泛的影响。到目前为止,也有很多软件可对其进行检测,今天我们就来了解一下这款常用可变剪切软件rMATS的最新版详情。

attachments-2024-04-J2lo4EX0660a2b0cec2a3.png

rMATS介绍

rMATS是检测可变剪切事件的常用软件之一,其可以从RNA测序数据中,检测出多种类型的可变剪切事件,并提供了定量和组间差异分析的功能,可对生物学重复的样本进行组间分析。rMATS可识别的可变剪切事件有5种:

Skipped exon (SE):外显子跳跃

Alternative 5' splice site (A5SS)5’端可变剪切

Alternative 3' splice site (A3SS):3’端可变剪切

Mutually exclusive exons (MXE):外显子互斥

Retained intron (RI):内含子保留

attachments-2024-04-FcoXPZCZ660a2b293843a.png

定量

rMATS采用exon inclusion level 来定义样本中可变剪切事件的表达量,以外显子跳跃(Skipped Exon)为例,正常的转录本称之为Exon Inclusion Isofrom, 发生了外显子跳跃的转录本则称之为Exon Skipping Isofrom。

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用 I 表示比对到Exon Inclusion Isofrom上的reads,S表示比对到Exon Skipping Isofrom上的reads, 则该外显子跳跃的可变剪切事件比例可以表示为:

attachments-2024-04-sErSJblZ660a2b546a02f.png

exon inclusion level实际上是inclusion isofrom所占的比例,计算时,用长度校正了原始的reads数。其他类型的可变剪切事件也可以划分成上述两种isoform, 示意图如下:

attachments-2024-04-d40acfVn660a2b70cc0d2.png可以看到,rmats在计算isofrom的长度时,提供了两种方式,二者的区别就在于是否考虑跳过的exon的长度。

软件安装

rMATS turbo是rMATS的C/Cython版本。主要的差别在于速度和存储资源上,rMATS turbo相较于rMATS速度要快100倍,存储使用要小1000倍,因此我们安装rMATS turbo。

attachments-2024-04-VsPOc1K4660a2b99ef3f8.png安装依赖:Python (either 2.7 or 3.6),BLAS,LAPACK,GNU Scientific Library,GCC,gfortran,CMake等。保证以上依赖均存在的情况下就可以进行安装了。其实安装好conda,这些基础的包均已包括了。

conda create -n my_rmats_env
conda activate my_rmats_env
conda install rmats-turbo
rmats-turbo --version

软件使用

参数说明:

python rmats.py -h
usage: rmats.py [options]
optional arguments:
 -h, --help            show this help message and exit
 --version             show program's version number and exit
  --gtf GTF             An annotation of genes and transcripts in GTF format
 --b1 B1               A text file containing a comma separated list of the
                        BAM files for sample_1. (Only if using BAM)
 --b2 B2               A text file containing a comma separated list of the
                        BAM files for sample_2. (Only if using BAM)
  --s1 S1               A text file containing a comma separated list of the
                        FASTQ files for sample_1. If using paired reads the
                        format is ":" to separate pairs and "," to separate
                        replicates. (Only if using fastq)
  --s2 S2               A text file containing a comma separated list of the
                        FASTQ files for sample_2. If using paired reads the
                        format is ":" to separate pairs and "," to separate
                        replicates. (Only if using fastq)
  --od OD               The directory for final output
  --tmp TMP             The directory for intermediate output such as ".rmats"
                        files from the prep step
  -t {paired,single}    Type of read used in the analysis: either "paired" for
                        paired-end data or "single" for single-end data.
                        Default: paired
  --libType {fr-unstranded,fr-firststrand,fr-secondstrand}
                        Library type. Use fr-firststrand or fr-secondstrand
                        for strand-specific data. Default: fr-unstranded
  --readLength READLENGTH
                        The length of each read
  --variable-read-length
                        Allow reads with lengths that differ from --readLength
                        to be processed. --readLength will still be used to
                        determine IncFormLen and SkipFormLen
  --anchorLength ANCHORLENGTH
                        The anchor length. Default is 1
  --tophatAnchor TOPHATANCHOR
                        The "anchor length" or "overhang length" used in the
                        aligner. At least "anchor length" NT must be mapped to
                        each end of a given junction. The default is 6. (Only
                        if using fastq)
  --bi BINDEX           The directory name of the STAR binary indices (name of
                        the directory that contains the SA file). (Only if
                        using fastq)
  --nthread NTHREAD     The number of threads. The optimal number of threads
                        should be equal to the number of CPU cores. Default: 1
  --tstat TSTAT         The number of threads for the statistical model.
                        Default: 1
  --cstat CSTAT         The cutoff splicing difference. The cutoff used in the
                        null hypothesis test for differential splicing. The
                        default is 0.0001 for 0.01% difference. Valid: 0 <=
                        cutoff < 1. Does not apply to the paired stats model
  --task {prep,post,both,inte}
                        Specify which step(s) of rMATS to run. Default: both.
                        prep: preprocess BAMs and generate a .rmats file.
                        post: load .rmats file(s) into memory, detect and
                        count alternative splicing events, and calculate P
                        value (if not --statoff). both: prep + post. inte
                        (integrity): check that the BAM filenames recorded by
                        the prep task(s) match the BAM filenames for the
                        current command line
  --statoff             Skip the statistical analysis
  --paired-stats        Use the paired stats model
  --novelSS             Enable detection of novel splice sites (unannotated
                        splice sites). Default is no detection of novel splice
                        sites
  --mil MIL             Minimum Intron Length. Only impacts --novelSS
                        behavior. Default: 50
  --mel MEL             Maximum Exon Length. Only impacts --novelSS behavior.
                        Default: 500

运行:

##/path/to/b1.txt
/path/to/1_1.bam,/path/to/1_2.bam
##/path/to/b2.txt
/path/to/2_1.bam,/path/to/2_2.bam
###运行
python rmats.py --b1 /path/to/b1.txt --b2 /path/to/b2.txt --gtf Gallus_gallus.GRCg6a.101.gtf --od A_vs_B --tmp A_vs_B/tmp -t paired --variable-read-length --readLength 150 --cstat 0.0001  --libType fr-unstranded  --novelSS --nthread 4

--b1 为组别1的bam文件的路径,若有生物学重复则bam文件路径用逗号隔开;

--b2 为组别2的bam文件的路径,若有生物学重复则bam文件路径用逗号隔开;

--gtf 为已知的基因及转录本的gtf文件;

--od 即为输出路径;

-t 测序类型为单端或者双端 ;

--variable-read-length 能够允许不同长度的长度的reads进行分析;

--readLength 若长度不一致时,可使用该参数将reads截取到给定的数值;

--libType 文库类型,可选择是否为链特异性;

--tmp 暂存目录;

--nthread 线程数。


输出文件详情请查看:https://github.com/Xinglab/rmats-turbo/blob/v4.2.0/README.md


  • 发表于 2024-04-01 11:36
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  • 分类:软件工具

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安生水
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