蛋白纯化过程中的七大常见问题详解

重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构,研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质,然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。在蛋白纯化的过程中,我们可能会遇到一些问题。让我们一起来看看这些问题,并探讨相应的解决方案吧!

重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构,研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质,然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。在蛋白纯化的过程中,我们可能会遇到一些问题。让我们一起来看看这些问题,并探讨相应的解决方案吧!

 

蛋白纯化过程中的七大常见问题详解:

 

1. 通过 His 标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?

 

①若纯化的是上清液,蛋白酶可能会对目的蛋白产生部分降解作用。为改善此情况,可尝试加入多种蛋白酶抑制剂。

 

②为降低杂蛋白与镍柱的亲和力,可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。

 

③若杂蛋白与目的蛋白结合,可在超声处理前加入适量的去垢剂(如1%-2% Tritonx-100),以消除此现象。

 

2. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

 

当使用镍柱时出现棕色,这主要是由于缓冲液中的 DTT 引起的。DTT 对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响。在碱性缓冲液条件下,镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀。因此,所有的镍柱生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与。一般来说,镍柱的耐受性小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过 2mM DTT。

 

3. 镍柱堵了怎么办?

 

①样品处理:在样品中可能存在细胞碎片或其他杂颗粒,这些杂质可能会导致柱子堵塞。因此,在将样品加载到柱子上之前,必须对样品进行高速离心处理,以确保只加载纯净的样品。

②加入蛋白酶抑制剂:如果在纯化上清液时发现蛋白变性,产生了絮状物,应立即加入1-2mM DTT,以避免变性导致的蛋白质聚集。加入DTT的操作应在冰浴中进行。如果加入DTT后问题仍未解决,可以进一步加入尿素以变性蛋白质,使其在变性环境下稳定。

③调整料液比:样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大或导致蛋白析出或变性。料液比在1/10-1/15之间较为适宜。

 

4. 纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?

 

在纯化过程中,如果蛋白出现浑浊,可能是由于蛋白处于不稳定的环境中或其本身不稳定所导致的。因此,需要检查缓冲体系是否正确以及环境是否低温。此外,为了提高蛋白的稳定性,可以在缓冲液中加入还原剂DTT。另一种解决方案是加入肌氨酸钠,这可以迅速使蛋白变性并消除浑浊现象。

 

5. 没能纯化到带 His 标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?

 

①超声功率问题:

超声功率过大可能导致蛋白炭化,而过小则可能使蛋白没有充分释放。

策略:尝试调整超声功率,并在超声处理前加入适量的溶菌酶。

 

②样品及结合缓冲液问题:

样品或结合缓冲液的pH值不正确,或缓冲液中的成分(如EDTA)可能影响蛋白的结合。

策略:检测样品和结合缓冲液的pH值以及成分,确保它们是正确的和适合的。

 

③组氨酸标签暴露问题:

如果组氨酸标签没有完全暴露,将影响蛋白与镍柱的结合。

策略:在变性条件下(如使用8M脲,6M盐酸胍,1%SDS),并加入1-2mMDTT进行纯化。

 

④His标签丢失问题:

His标签丢失可能是由于蛋白在纯化过程中发生了降解或脱落。

策略1:通过WB或anti-his抗体检查His标签是否存在,检查上游构建是否正确,并尝试改变His-tag的位置(C-terminal或N-terminal),必要时增加His标签的数量。

策略2:孵育时间不足可能导致蛋白未能充分结合。降低流速并增加孵育时间可能有助于提高蛋白的结合效率。

策略3:不同的金属离子可能对蛋白与镍柱的结合产生影响。尝试改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。例如,Ni2+通常是首选的金属离子用于从宿主细胞蛋白中纯化大多数组氨酸6标记的重组蛋白质。但是,有些蛋白可能更适合使用其他金属离子进行纯化而非Ni2+。可以通过Hitrap IMACHP来筛选不同的金属离子。

 

6. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?

 

①洗脱条件太温和:

如果洗脱条件过于温和,可能导致组氨酸标记的蛋白质仍然与柱子结合,因为结合力较强。

策略:尝试增加咪唑的梯度洗脱,或者降低pH来找出最佳的洗脱条件。

 

②降低pH方法洗脱的问题:

如果使用降低pH的方法进行洗脱,但pH值过低可能会导致镍离子脱落。

策略:改变洗脱方法,使用咪唑竞争性洗脱。

 

③蛋白已沉淀在柱上的问题:

有时蛋白可能已经沉淀在柱上。

策略:减少上样量和孵育的时间,尝试使用去污剂(如1%-2% Tritonx-100)或改变NaCl的浓度。还可以在变性条件下进行洗脱(如使用8M脲或6M 盐酸胍),最终也可以在洗脱Buffer中加入2mMDTT或者0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

 

④非特异性疏水或其他相互反应的问题:

可能是由于非特异性疏水或其他相互反应导致蛋白挂在柱子上。

策略:在洗脱缓冲液中加入非离子去污剂(如2% Triton X-100)或者增加NaCl的浓度。

 

7. 如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?

 

(1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。

 

(2)去大肠杆菌自身带(两条 30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。

 

(3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可选取其中纯度最佳的。

 

(4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。

 

更多关于蛋白纯化相关问题的可以查看https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification

 

 

  • 发表于 2023-10-24 13:43
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xiaoqin2023
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