蛋白纯化的原理、操作及注意事项有哪些?

不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构,导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。

蛋白纯化的原理:

不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构,导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。

 

大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失,假设每一步的获得率为80%。因此,建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。

 

在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下,可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段,每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。

 

 

蛋白纯化实际操作:

 

理想情况下,最终的纯化过程包括样品制备,其中包括在需要时进行萃取和澄清,然后进行上述三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。

 

分析纯化通常利用三个特性来分离蛋白。首先,蛋白可以通过pH梯度凝胶或离子交换柱,根据其等电点进行纯化。其次,根据蛋白大小或分子量,可以通过体积排除色谱法分离或通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析。通常采用2D-PAGE对蛋白进行纯化,然后进行肽质量指纹图谱分析,以确定蛋白的特性。这对于实现科学目的非常有用,目前蛋白的检测限非常低,纳克级的蛋白足以用于分析。

 

 

如何应用纯化原则:

①纯化技术的选择和组合:

这种组合的目的是发展出一条最快的方法来获得所需纯度的产品。对于任何色谱分离来说,不同的技术在回收率、分辨率、速度和容量方面的表现都各不相同。我们可以对一种技术进行优化,使其专注于其中一个参数;例如分辨率要在速度和容量两个参数之间达到最佳。

 

分辨率是通过技术的选择和色谱基质产生窄峰的效率来实现的。一般来说,此时目标蛋白和杂质具有非常相似的性质,分辨率是最难实现的。

 

②标签蛋白的纯化:

在蛋白中添加标签可以使蛋白具有它本来不具有的结合亲和力。通常重组蛋白是混合物中唯一具有这种亲和力的蛋白,有助于蛋白分离。最常见的标签是对镍或钴离子有亲和力的组氨酸标签(His标签)。因此,我们通过将镍离子或钴离子固定在树脂上,可以创建与组氨酸标签蛋白特异性结合的亲和介质。

 

③评估纯化产量:

通常使用SDS PAGE监测纯化过程中的不同步骤。这一方法只能粗略地测量混合物中不同蛋白的量,并且无法区分具有相似分子量的蛋白。为了评估多步纯化的过程,必须将特定蛋白的量与总蛋白的量进行比较。

 

 

蛋白表达纯化实验中注意事项有哪些?

 

1. 选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。

 

2. 融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

 

3. 菌液OD值要小于1,否则细胞太浓太老,不易破碎,且质粒易丢失。

 

4. 诱导时间最好做一个梯度,不同蛋白诱导时间需摸索。

 

5. 诱导温度适当摸索。

 

6. IPTG浓度:一般在1 mM 以内,可适当摸索。

 

7. 超声条件可视实际情况改变,只要使菌体裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠。

义翘神州提供原核蛋白纯化服务,服务内容包括:

①基因合成及密码子优化

②载体构建

③表达鉴定和可溶性分析

④放大表达和1-2步纯化

⑤大量表达及纯化

 

更多详情可以关注:https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service

  • 发表于 2023-09-21 14:59
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xiaoqin2023
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