杂交瘤技术制备单克隆抗体:详细流程与常见问题解析

杂交瘤技术是一种将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合,产生永生化杂交瘤细胞系,然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆,并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。 利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为:抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。在单克隆抗体制备过程中,常常会遇到细胞污染,细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题,本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。

杂交瘤技术是一种将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合,产生永生化杂交瘤细胞系,然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆,并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。

 

利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为:抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。在单克隆抗体制备过程中,常常会遇到细胞污染,细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题,本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。

 

 

一、微生物污染

 

①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子,如果操作不当,或者是未能及时到位的消杀,就有可能会引入污染。除此之外,还须注意平时使用的一些消毒剂,比如84消毒液或者75%酒精,要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位,是非常不容易发现的。

②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的SP2/0细胞圆润透亮,当被支原体污染后,短期内细胞没有明显的变化,当污染严重后,细胞生长会变得极为缓慢,生长周期变长,细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂,或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔,待产生实体瘤后或产生腹水后,无菌分离重新获得杂交瘤细胞。

③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫,污染后会陆续出现多少不等的小黑点。

 

二、融合后细胞不生长

①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性,部分毒性试剂作用时间过长引起的。如PEG在10%~60%都可以进行融合,但浓度越高毒性越大。

②也有可能是使用血清质量比较差,推荐使用胎牛血清。

③还有可能是因为添加的HAT试剂中氨基喋呤(A)含量过高或HT(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)含量过低。

 

 

三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体

 

1、杂交瘤细胞不分泌抗体,可能的原因有以下几种:

a.抗原免疫原性弱,免疫效果不好,可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估;

b.操作过程中脾细胞损伤较多,抗原特异性淋巴母细胞大量死亡;

2、杂交瘤细胞前期有抗体分泌,后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体,可能的原因有以下几种:

a.HAT试剂中氨基喋呤(A)失效,骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长;

b.未及时克隆,不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间;

c.骨髓瘤细胞返祖化,抵抗氨基喋呤(A)的选择;

d.梁色体丢失(突变);

e.支原体污染。

解决方法有三种:第一,及时进行细胞建库;第二,高频次检查细胞状态和是否污染;第三,定期进行抗原筛选。

 

四、杂交瘤细胞难以克隆化

 

一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞,就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体,反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化,可以尝试以下解决方法:

 

①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选,确定最佳批次的血清和使用浓度;

②融合后第一次克隆(一亚)仍需采用含HT的条件培养;

③在培养体系中加入白细胞介素6(IL6),一般商品化的杂交瘤因子都含有IL6。

 

义翘神州提供杂交瘤测序服务杂交瘤细胞培养及抗体生产服务,具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看

杂交瘤技术:https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology

  • 发表于 2023-10-13 16:41
  • 阅读 ( 1965 )
  • 分类:其他

你可能感兴趣的文章

相关问题

0 条评论

请先 登录 后评论
xiaoqin2023
xiaoqin2023

32 篇文章

作家榜 »

  1. omicsgene 694 文章
  2. 安生水 341 文章
  3. Daitoue 167 文章
  4. 生物女学霸 120 文章
  5. 红橙子 78 文章
  6. xun 77 文章
  7. rzx 74 文章
  8. CORNERSTONE 72 文章