GST标签纯化蛋白的优劣势及常见问题解析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是一个由211个氨基酸组成的大小为26kDa序列,它是另一种广泛使用的可提高靶蛋白的溶解度亲和标签。GST标签与固定化的谷胱甘肽具有亲和力,常用于原核表达。它可以与一个蛋白的N端或C端融合。 谷胱甘肽亲和是一种有效的一步纯化GST(谷胱甘肽S-转移酶)标签蛋白的方法。GST可作为一种可溶性蛋白在大肠杆菌细胞质中大量表达,并具有完全的酶活性。此外,许多在大肠杆菌中表达时不溶的真核蛋白,在表达为GST标签蛋白时被证明至少部分可溶。

GST标签是什么?

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是一个由211个氨基酸组成的大小为26kDa序列,它是另一种广泛使用的可提高靶蛋白的溶解度亲和标签。GST标签与固定化的谷胱甘肽具有亲和力,常用于原核表达。它可以与一个蛋白的N端或C端融合。

 

谷胱甘肽亲和是一种有效的一步纯化GST(谷胱甘肽S-转移酶)标签蛋白的方法。GST可作为一种可溶性蛋白在大肠杆菌细胞质中大量表达,并具有完全的酶活性。此外,许多在大肠杆菌中表达时不溶的真核蛋白,在表达为GST标签蛋白时被证明至少部分可溶。

 

GST标签纯化蛋白的优劣势:

优势:

1.适用范围广,可在不同宿主中表达;

 

2.增强外源蛋白可溶性;

 

3.可用不同的蛋白酶进行去除;

 

4.有助于保持蛋白的抗原性与生物活性,提高外源蛋白的稳定性;

 

5.特异性好,纯化方便且温和。

 

劣势:

 

1.分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验;

 

2.仅能纯化可溶性蛋白,若蛋白不可溶,则很难用变性的方法纯化。

 

GST标签纯化蛋白常见问题解析:

1、GST 融合蛋白的产量低或无法检测到

 

原因1:融合蛋白形成包涵体

 

解决方案:

①采用低温(16∽25℃)培养细胞,或者诱导过程中降低诱导剂的终浓度至1mM,或者缩短诱导时间。

 

②纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶在摇床上轻摇2个小时或者更长时间(过夜),充分结合后上柱纯化。

 

原因2:融合蛋白可能失活

解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件,比如采用溶菌酶。

 

原因3:融合蛋白被蛋白酶降解

解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂,如PMSF。

 

原因4:融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来

解决方案:

①延长洗脱时间,或者增加洗脱液中还原性谷胱甘肽的浓度至15mM或者更高,调节洗脱液的pH值至8.0∽9.0。

②在洗脱液中加入Triton X-100(终浓度0.1%)、辛基-葡萄糖苷(终浓度2%)或者NaCl(终浓度0.1∽0.2 M)。

 

 

2、洗脱液中有较多杂带

 

原因1:融合蛋白被蛋白酶降解

解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂如PMSF。

 

原因2:些宿主蛋白,比如伴侣蛋白,可能会和融合蛋白互相作用

解决方案:在洗涤液中加入DTT(终浓度5 mM)。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM   Tris-HCl),37℃振荡10 min

 

原因3:过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合

解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件。

 

原因4:有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合

解决方案:优化洗涤条件:加入一些洗涤剂如1%   Triton X-100、1%Tween-20、0.03%   SDS 或者0.1% NP-40 可以降低非特异性吸附。优化洗涤液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附。

 

更多详情可以查看:GST标签蛋白纯化:https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression

 

 

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