技巧总结:Annexin V/PI法测细胞凋亡中的注意事项

在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的胞浆侧。细胞发生早期凋亡后,PS外翻到胞膜侧,Annexin V对PS有高度亲和力,用FITC标记Annexin V,PS外翻的细胞由于结合Annexin V-FITC发出绿色荧光。

大名鼎鼎的Annexin V-FITC/PI双染法,是大家最常的流式凋亡检测方法。但是想得到一组既漂亮又“炫”的流式结果图却不是一件容易的事情,需要同学们每一步都做到精致完美,任何一个小环节的失误,都会使几天的努力功亏于溃,毁于一旦。

那么,整个细胞凋亡实验过程需要注意些什么问题?有哪些不能忽略的实验小细节呢?今天,我们一起来学习学习。

Annexin V-FITC/PI双染法基本原理

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在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的胞浆侧。细胞发生早期凋亡后,PS外翻到胞膜侧,Annexin V对PS有高度亲和力,用FITC标记Annexin V,PS外翻的细胞由于结合Annexin V-FITC发出绿色荧光。凋亡晚期,细胞膜结构受损,碘化丙啶(PI)透过细胞膜进入细胞,细胞同时发出红色荧光和绿色荧光。同时检测Annexin V-FITC(绿色荧光)和PI(红色荧光)的信号,对早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例进行分析。

实验中的小细节

一、如果可以,尽量选择活力旺盛的“青年”细胞

细胞凋亡想做好,细胞状态选择最重要。

为什么要选择活力旺盛的细胞?大家都知道生长代数越靠前的细胞活力越旺盛,在条件容许的前提下,尽量选取传代次数较少的细胞。

为什么要选择“青年”的细胞?培养器皿中的细胞是一个微形群体。传代后,营养物质充裕,细胞群体中的“baby”细胞比较多。随着不断生长分裂,细胞数越来越多。当细胞融合度达到80%左右时,群体中的“青年”细胞的比例达到顶峰,此时的细胞状态最好,最适宜做凋亡实验。如果细胞继续培养,生存空间不足,营养物质匮乏,“老年”细胞逐渐变多,此时检测到细胞本身凋亡百分率就会很高。

二、过度消化会损伤细胞

流式检测的样本必须是单细胞悬液,对于贴壁培养的细胞,需要用胰酶降解细胞间结合处蛋白,使细胞相互分离。但胰酶是一把双刃剑,如果处理时间太长,也会损伤细胞。所以需要尽量去除延长消化时间的因素,比如,尽量去除清洗培养基的PBS,避免残留PBS稀释胰酶。当样本较多时,建议分组消化细胞,严格控制胰酶处理时间在1分钟内。

三、胰酶消化,加EDTA or not?

EDTA螯合钙离子,影响Annexin V和细胞膜上的蛋白结合,因此许多凋亡试剂盒的protocol都特别标明,用于细胞凋亡实验的胰酶不能含有EDTA。从另一个方面讲,胰酶中加入EDTA,可以加快细胞从培养器皿上脱离的速度,避免胰酶长时间消化造成的细胞损伤。

胰酶中到底要不要加EDTA?是一个两难的选择?

其实,应该具体问题具体分析,有的细胞容易消化,当然用不含EDTA的胰酶。如果用胰酶消化几分钟后,大部分细胞仍然牢牢地吸附在培养器皿上,就建议选择含有EDTA的胰酶消化细胞,可以通过洗涤去除EDTA来保证Annexin V和细胞膜上的蛋白结合。

四、染色前或染色后的细胞可不可以固定?

当然不可以。如果你温习细胞凋亡检测的基本原理,就知道,固定会破坏细胞的完整性,使PI透过细胞膜进入细胞,提高细胞的凋亡百分率。所以,染色前和染色后的细胞都不可以固定,并且染色后的细胞需要在1小时内上流式检测。

五、表达GFP荧光的细胞是否可以使用此方法检测?

当然不可以。GFP和FITC都由488nm激光激发,二者发射光谱有极大的重叠。如果表达GFP荧光的细胞用此法检测细胞凋亡,FL1通道获得的荧光信号就是GFP和FITC的加和,不能真实地反应细胞凋亡的变化。所以,被检测细胞本身不能发出与FITC或者PI染料有光谱重叠的光。如果有,果断换用其他检测方法。

六、每个细胞都需要被温柔以待!

机械力会损伤细胞,操作过程中的任何暴力行为,都会使细胞本身凋亡百分率变高。要想实验结果好,尽量地少吹打细胞,因为每个细胞都值得被温柔以待!

注意好以上这些小细节,你才能得到一张“炫”丽多彩的流式结果图,但是,如果细节都到位了,实验还是做不好该怎么办?——或许你可以尝试使用更优质的Annexin V-FITC/PI检测试剂盒。

推荐——Procell Annexin V-FITC/PI检测试剂盒

Procell自主研发的Annexin V系列凋亡试剂盒,用于鉴定凋亡和坏死的细胞,特异性强,灵敏度高,操作简便快捷,质量过硬,可满足您的多种需求,对比其它品牌的试剂盒,优势如下:

1、多种标记物(FITC、PE、APC、AF647/PI、7-AAD)选择,满足不同待测样本和检测仪器的需求;

2、多种试剂盒相关组分在售,灵活满足不同的实验需求;

3、检测早期凋亡最理想的方法,不需固定环节从而避免相关的假阳性;

4、只需15-20分钟,简单快捷;

5、严格可靠的质量控制,保证优异的实验结果;

6、专业的售前售后技术支持,帮助您更好完成凋亡实验。

实验效果图如下:

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图:Jurkat细胞用1μM喜树碱(Camptothecin) (左) 或未加药 (右) 处理4 h,Annexin V-FITC/PI检测试剂盒染色后FCM检测。Annexin V-FITC单阳为早期凋亡细胞,Annexin V-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞,PI单阳细胞为裸核细胞。

怎么样,是不是非常地“炫”呢?

好了,学霸姐姐只能帮你到这里了,剩下的,就靠你自己了!

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生物女学霸,一个自称学霸其实很渣的生物汪,
努力将有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事儿呈现给大家,
关注一个好不啦~
  • 发表于 2019-12-24 16:03
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  • 分类:实验相关

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