宏基因组测序技术是进行微生物资源开发利用、加速微生态科研深度研究的重要手段。随着高通量测序技术的普及，越来越多的研究人员开始着手与宏基因组分析。

但是，有相当一部分研究人员由于是初次接触宏基因组分析，对分析结果缺乏系统的了解，无法高效的挖掘和研究目的相关的结果，进而影响了文章的发表以及成果的转化。

课程内容

第一节：宏基因组基础知识

• 课程目标：快速掌握微生物群落结构、功能及生态学意义，理解物种信息表和功能信息表的核心内容
• 内容包括：
  • 微生物群落结构与功能的基本概念：什么是宏基因组学？物种丰度表与功能信息表的作用
  • 生态学意义：微生物群落与环境、宿主间的关系（如肠道菌群与健康）
  • 数据表解读：物种丰度表（OTU/ASV表）结构、功能信息表（GO、KEGG）的组成与应用

第二节：Venn和UpSet图

• 课程目标：掌握绘制Venn图和UpSet图，展示物种或功能的分布与重叠
• 内容包括：
  • Venn图与UpSet图的用途：展示物种或功能在不同样本间的重叠与独特性，突出样本间共有与独特元素的分布模式
  • 使用R（ggVennDiagram、eulerr、UpSetR包）绘制不同特点的Venn图和UpSet图
    §ggVennDiagram：绘制多组的Venn图，支持自定义颜色、标签和交集标注§eulerr：生成精确的Venn图，优化重叠区域的视觉表现，适合复杂数据集§UpSetR：绘制UpSet图，展示多组交集的矩阵式分布，突出高维数数的关系

第三节：物种组成堆叠柱状图

• 课程目标：掌握绘制堆叠柱状图，展示物种丰度或功能分布
• 内容包括：
  • 堆叠柱状图：使用ggplot2绘制物种丰度分布，设置颜色分组和图例，展示不同样本或组别的丰度模式
  • 使用ggalluvial绘制流动图：展示物种或功能在不同样本间的流动与分布，如何在图表中加入分组横条，突出动态变化
  • 绘图优化：通过修改因子（factor）调整图例中物种或功能的顺序，优化视觉呈现和解读

第四节：物种丰度比较热图

• 课程目标：掌握绘制热图，展示物种或功能的多维分布与模式
• 内容包括：
  • 热图：使用pheatmap包绘制物种或功能的丰度矩阵，展示多维分布与模式
  • 多种热图类型：学习绘制层次聚类热图（基于距离和聚类方法）、非层次聚类热图（按自定义顺序）和双向聚类热图（同时聚类行和列）
  • 桑基图与热图结合：使用R 和相关包（如networkD3、pheatmap）绘制桑基图与热图相结合的图表，展示物种或功能在不同样本间的流动与分布模式

第五节：Alpha多样性箱图

• 课程目标：掌握绘制多种类型的Alpha多样性图，分析微生物群落多样性特征
• 内容包括：
  • 多种类型的Alpha多样性图：使用ggplot2绘制以下图表，展示群落内多样性，突出不同样本或组别的多样性差异：

    §普通箱图：绘制Shannon、Simpson指数的箱线图，展示中位数、四分位距和离群值    §提琴图：绘制提琴图，展示数据分布密度    §缺口图（Notched Boxplot）：绘制带缺口的箱图，比较不同组别中位数的显著性差异    §箱图和提琴图结合的图：综合展示分布和统计信息    §半箱图和半提琴图：绘制半箱图（仅显示一半箱线）和半提琴图（仅显示一半密度分布），优化空间利用和对比效果

• • 统计检验: 学习t检验、Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis检验，用于比较不同组别或样本的Alpha多样性指数（如Shannon、Simpson、Chao1、ACE指数）差异，结合P值校正（如FDR）确保结果可靠性
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第六节：Beta多样性散点图和箱图

• 课程目标：掌握绘制Beta多样性散点图和箱图，展示微生物群落间差异
• 内容包括：
  • Beta多样性散点图和箱图：使用ggplot2和phyloseq绘制PCoA/NMDS散点图和箱图，展示不同样本或组别的群落间距离与差异
  • 多种优化类型：

    §PCoA/NMDS散点图：绘制带颜色编码的散点图，突出样本分组（按环境或处理分组），添加置信椭圆（confidence ellipses）或凸包（convex hulls）增强可视化    §Beta多样性箱图：绘制基于距离矩阵（如Bray-Curtis、Jaccard）的箱图，展示群落间差异的中位数和分布范围    §散点图与箱图,山脊图结合：展示样本分布的密度轮廓，提升美观性和信息密度

• • 假设检验：学习PERMANOVA（Adonis）检验、ANOSIM检验用于比较不同组别或样本的Beta多样性距离（如Bray-Curtis、Jaccard距离）差异，结合P值校正（如FDR）评估群落结构显著性差异
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第七节：差异分析（火山图、LEfSe柱状图和误差条图）

• 课程目标：掌握差异分析的可视化，识别差异微生物或功能
• 内容包括：
  • 差异分析：绘制火山图（ggplot2）、LefSe分支进化图（R包）和误差条图，识别显著差异的物种或功能
  • 具体类型与优化：

    §火山图：使用ggplot2绘制火山图，展示差异微生物的log2折叠变化（log2FC）与P值或调整后的P值（-log10P），标注显著性阈值（如log2FC > 1，adj.P < 0.05），突出上调和下调的物种    §LEfSe分支进化图：使用LEfSe R包绘制图, 标识在不同组别中显著富集的微生物或功能    §误差条图：绘制误差条图（errorbar），展示不同数据拼合后的物种或功能的平均丰度及其标准误差（SEM）或置信区间（CI），突出不同组别间的差异，呈现拼合数据的变化


    §统计检验：学习t检验、Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis检验，用于比较组间微生物或功能的丰度差异；使用FDR（False Discovery Rate）或Bonferroni校正控制多重检验错误

第八节：基因差异和富集分析

• 课程目标：掌握基因水平差异分析与功能富集的可视化
• 内容包括：
  • 基因差异分析：识别基因水平的显著差异，绘制相关图表，展示差异特征：

    §火山图：使用ggplot2绘制基因的log2FC与P值或调整后的P值（-log10P）突出上调和下调基因。    §柱状图：绘制显著差异基因的丰度或表达量变化，优化颜色分组和排序，突出关键基因。

• • 功能富集分析：使用KEGG/GO数据库进行富集分析，绘制富集分析图，展示功能分布：

    §富集分析图：使用ggplot2或clusterProfiler R包绘制KEGG富集泡泡图，展示富集的代谢通路。

• • 统计检验: t检验、Wilcoxon秩和检验用于基因差异分析；使用Fisher精确检验或超几何分布检验进行功能富集分析，结合P值校正（如FDR）评估显著性

第九节：环境因子分析

• 课程目标：掌握环境因子与微生物关系的可视化，探索相关性
• 内容包括：
  • 环境因子分析：结合环境变量（如pH、温度、湿度），绘制相关性图表，展示微生物与环境间的关系：

    §相关性散点图：使用ggplot2绘制物种丰度与环境变量（如pH）的散点图，添加拟合线（线性或非线性）和相关系数（Spearman/Pearson），突出正/负相关性

    §相关性热图：使用ggplot2绘制环境变量与微生物丰度的相关性矩阵，优化颜色渐变和标签，展示多维相关模式。

第十节：相关性网络

• 课程目标：掌握绘制微生物或功能的共存网络，识别关键节点
• 内容包括：
  • 相关性网络：使用igraph构建共存网络，展示物种或功能间的关系：

    §网络构建：使用igraph计算Spearman或Pearson相关系数，生成有向/无向网络，设置相关性阈值（如>0.6或<-0.6）筛选显著边   

    §网络可视化：绘制节点（物种或功能）和边（相关性）的网络图，优化节点大小（按度数或丰度）、颜色（按分类或模块）和边粗细（按相关性强度）
    §关键节点识别：使用igraph分析网络中心性（如度中心性、介数中心性），突出生态学重要性节点

第十一节：随机森林（分类和回归）

• 课程目标：掌握使用随机森林进行微生物分类和回归分析的可视化
• 内容包括：
  • 随机森林应用：使用R Markdown和randomForest包进行分类和回归分析，预测微生物与环境/功能的关系：

    §分类分析：使用randomForest进行微生物群落分类（如健康/疾病状态），绘制混淆矩阵热图（confusion matrix）或分类精度图，评估模型性能   

    §回归分析：使用randomForest预测微生物丰度与环境变量（如pH、温度）的关系，绘制回归预测图或重要性排序图（variable importance plot）
    §可视化优化：调整图表颜色、标签和图例，突出重要变量和预测结果，生成符合文献要求的专业可视化。

第十二节：肠型分析

• 课程目标：掌握肠型分析的可视化与应用，理解肠道微生物群落的典型模式
• 内容包括：
  •     肠型分类：识别常见肠道微生物群落类型（如Enterotype 1、2、3），基于物种丰度表进行聚类分析：

    §聚类方法：使用R Markdown和stats包（如k-means或PAM聚类）识别肠型，基于物种丰度表的主成分分析（PCA）或PCoA   

    §可视化：绘制PCA散点图或PCoA散点图，标注肠型分组（颜色编码），突出不同肠型的分布模式


第十三节：分箱结果系统发育树绘制

• 课程目标：了解宏基因组数据的分箱目的和结果类型,并借助分箱结果绘制多种类型的系统发育树
• 内容包括：
  •     进化树的解读和简单修改：了解进化树的一些基本知识,并对其做一些简单的修改：

    §R包介导的进化树美化：对于矩形进化树,可以直接借助R包来进行美化   

    §高级可视化：对于一些复杂的圆形进化树,很难在R里直接得到想要的结果,所以我们借助R生成一些注释文件,并通过itol网站进行进化树的美化

第十三节：分箱结果功能展示

• 课程目标：了解常见宏基因组数据分箱结果的展示类型
• 内容包括：
  •     功能组成饼图：对功能的层级结构多采用旭日图进行展示

    §热图: 对于不同mags的结果的功能丰度用热图展示   

    §箱图: 对于不同分类层级的物种拥有的对应功能数目用箱图展示

课程目录展示

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