浅谈几种常用的蛋白互作实验研究方法!

随着分子生物学研究方法的发展,很多的研究领域都越来越多的分析到了蛋白层面,下面我们就简单介绍几种常用的蛋白互作研究方法: 酵母双杂交: 酵母双杂交由Fields在1989年提出,它的产生...


随着分子生物学研究方法的发展,很多的研究领域都越来越多的分析到了蛋白层面,下面我们就简单介绍几种常用的蛋白互作研究方法:


酵母双杂交:

酵母双杂交由Fields在1989年提出,它的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域,位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activati 酵母双杂交模型on domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合。而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。

Fields建立了一个双杂交系统,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动特异基因序列的转录。构建BD-X蛋白载体及AD-Y蛋白载体,并且共同转载到含有lacZ报告基因的酵母菌株(常用的例如AH109),如果X蛋白与Y蛋白互作,那么含有BD-X蛋白载体及AD-Y蛋白载体的酵母菌株就会在缺陷营养培养基上生长,用来判断两个蛋白是否互作。


双分子荧光互补技术BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation)

是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段,分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合,只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下,两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白,发出荧光。活细胞收集后,在流式细胞仪中的检测是实时进行的,只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号,因此,不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。植物蛋白在研究时一般使用将载体转入农杆菌,再用农杆菌侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察烟草表皮细胞中的是否发荧光,来判断蛋白是否互作。


免疫共沉淀(CoIP)
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法,属于免疫沉淀技术的一类,常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来,进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员,或者是鉴定两种蛋白是否互作。免疫共沉淀的特点可以概括为两点,第一是天然状态,第二是蛋白复合物。免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合,避免了人为的影响,因此符合体内实际情况,得到的蛋白可信度更高。


Pull down技术
Pull down技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),但细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
 

在分析蛋白互作时一般回先使用前两种方法来判断蛋白是否互作,因为前两种方法相较与免疫共沉淀和Pull down技术比较容易实现而且所需要的试剂也便宜,酵母双杂跟Bifc的缺点就是假阳性高,如果只用这两种方法验证蛋白互作,你在发表文章时编辑也不太认可,因此想要发高分文章就必须进行免疫共沉淀或者Pull down分析,进一步确定两个蛋白互作。



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