内参基因的选择?!

做过高通量测序的小伙伴都会遇到荧光定量PCR验证工作,初次接触的话,挑选内参基因有时是个让人头疼的事,今天小编就和大家聊一聊内参基因选择的那些事!假如您有QPCR验证实验需求,可以联系我...
做过高通量测序的小伙伴都会遇到荧光定量PCR验证工作,初次接触的话,挑选内参基因有时是个让人头疼的事,今天小编就和大家聊一聊内参基因选择的那些事!假如您有QPCR验证实验需求,可以联系我们,我们会为您提供专业快捷质优价廉的实验服务!详询微信llcheng1314。

 内参基因简介

内参基因一般都挑选管家基因,管家基因(持家基因)是一类高度保守、甲基化水平低并且持续处于活性转录状态的基因,其表达水平不易受环境因素影响,一般是维持细胞最低限度功能所需的基因,如组蛋白编码基因、核糖体蛋白编码基因、线粒体蛋白基因等。

内参基因筛选条件

(1)无组织特异性,各组织中表达无明显差异;
(2)表达水平与细胞周期、活化无关;(3)表达不受外源或内源因素影响;(4)表达量不要太高或太低,中等表达量为宜;(5)不存在假基因;

内参基因的选择

1. 检测mRNA(LncRNA)和蛋白的表达
QPCR检测mRNA表达差异或做Western blot应该是最常见的,内参通常选择:Bata-actin、GAPDH、18S rRNA。
(1)GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写,经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中,并且在细胞中含量丰富,占总蛋白的10%-20%;GAPDH基因序列高度保守,在同种细胞或者组织中的表达相对恒定,故常被用作qPCR或Western blot的内参基因。

attachments-2020-07-XLdHf1VP5f03341f1b2a5.jpg(2)Bata-actin即β肌动蛋白,是细胞骨架微丝、肌肉细丝的主要成分,在维持细胞结构、细胞内运动、细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用,该基因几乎在所有真核细胞中表达,广泛存在哺乳动物动物的组织与细胞内。

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(3)18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列,其编码基因rDNA(18S rRNA/rDNA)在生物演化过程中相当保守,存在于所有真核生物细胞中高峰度表达; 并且rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成,mRNA是由RNA聚合酶II合成,因此rRNA合成的调节独立于mRNA,在影响mRNA表达的各种条件下,各种rRNA水平很少发生变化。18S rRNA不适合选作内参的情况:rRNA转录易受到各种生物因素和药物的影响,在有丝分裂期间,28S、18S rRNA明显减少或不表达;另外rRNA不含poly(A)尾,在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录,所以建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外,还要用18S作为反向引物,反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下,再高温灭活。

attachments-2020-07-vzoC1fa45f033468476a1.jpg检测蛋白时,内参选择需要注意要和待检测蛋白分子量相差5KD以上,所以通常要根据待检测蛋白分子量来选择内参。2. 检测microRNA的表达对MicroRNA (miRNA) 的荧光定量验证有颈环法和加尾法:(1) 颈环法:miRNA长度只有20bp左右,所以没法根据其设计引物,于是,人们就先将其延长,也就是先加一个环状序列,这样就使得原来20bp左右的长度延伸为80bp左右,再根据这个80bp片段设计引物。
attachments-2020-07-Z2LoHQVD5f0334833f2a5.png2)加尾法:加尾法是用poly(A)聚合酶为成熟的miRNA加上poly(A)尾巴,然后用5’端带通用标签的Oligo-dT作为反转录引物,反转为加长的miRNA cDNA第1链,最后用与通用标签序列互补的反向引物进行染料法或者探针法的荧光定量PCR检测,这种方法可以批量地将所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴,然后进行反转录和检测。
attachments-2020-07-aenEr70N5f03349f753d1.png以上两种方法各有优缺点,颈环法只针对成熟miRNA,特异性相对较高,但操作繁琐,成本较高;加尾法可以检测到成熟miRNA及pre-miRNA,特异性稍低,但操作及引物设计简单。MicroRNA (miRNA) 的荧光定量验证时常用的内参包括U6、U1snRNA、5S rRNA、7SL RNA等,以及一些管家miRNA。3. 检测CircRNA的表达环状RNA的定量相对复杂一些,设置对照组比较重要,需要考虑可能存在的干扰因素:一般可以设置RNase R消化与不消化处理的对照,目的是排除线性RNA中可能存在的能被环状RNA定量PCR引物扩增的干扰序列;其次,建议增加不反转的对照或增加DNase I消化处理,排除DNA的污染。环状RNA的定量内参选择还没有明确的定论一般还是选择则,认可度较高的线性RNA内参。

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  • 发表于 2020-07-06 22:28
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红橙子
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