如今做过转录组的老师越来越多，但转录组后能辅以什么样的实验继续深入挖掘转录组数据呢？为了求证这个命题，小编搜索了18年三月最新的转录组文章，发现了两篇以积雪草（Centella asiatica）为材料的文章，并且是以同一个转录组数据连发的两篇SCI（2017年12月一篇；2018年3月一篇）；这两篇文章除了转录组的数据以外更是辅以基因克隆、qRT-PCR、原核/真核体外表达，体外酶活检测（液质联用）等，是小编看过的为数不多的多种实验手段为一体的文章，论文思路清晰，值得我们一起学习一下。下面我先介绍2017年12月的第一篇。

1. 背景简介：

积雪草别名铜钱草、马蹄草，属伞形科积雪草属草本植物，全株入药，用于湿热黄疸，中暑腹泻，石淋血淋，痈肿疮毒，跌扑损伤等。

积雪草中含有两种乌苏烷三萜类皂苷：积雪草皂苷和羟基积雪草皂苷。两种皂苷分子结构上都是积雪草酸加上糖基形成的，所以，本文主要内容是验证UGT （糖基转移酶）催化积雪草苷合成过程中的糖基化反应。积雪草苷合成路径见下图：

2. 转录组拼接unigenes并筛选UGTs：

茉莉酸甲酯（MeJA）可以有效提高积雪草叶片中积雪草苷的含量，所以作者用茉莉酸甲酯处理后24h的积雪草叶片进行转录组测序，最终拼接得到40064条unigene；接下来作者通过blast比对得到了133个作为UGT的候选unigene，其中37个具有完整的开放阅读框。并从中锁定了6个最有可能参与积雪草苷合成过程中催化糖基化的候选unigene，该6个候选基因有4个属于UGT73基因家族；2个属于UGT74基因家族。UGT基因家族进化树分析如下：

3. QRT-PCR结合发根培养物筛选候选unigenes：

接下来，作者又利用积雪草发根培养物进一步确认以上6基因是否参与积雪草苷的生物合成，作者依然是用茉莉酸甲酯处理积雪草发根，使用qRT-PCR检测以上6基因的表达模式变化情况，结果显示UGT73基因家族的4个基因在处理后12h表达开始上调，而UGT74家族的2个基因中一个基因未表现上调，另一个在处理及对照样品中均未检测到。通过qRT-PCR作者将候选基因范围进一步缩小至4个。

4. 候选基因原核表达：

将以上4个候选基因翻译成蛋白序列发现，这4个基因均有PSPG box，该结构是一个UGT糖基转移酶高度保守的结构域。为了进一步确认以上4个酶是否有催化糖基化的活性，作者将这4个基因转入大肠杆菌进行异源表达试验，如下图所示，4个基因中有2个有明显的蛋白产物。至此，作者已将候选基因范围缩小至2个。

5. 体外UGT酶活性检测：

最后作者回收大肠杆菌表达的候选酶并与底物尿苷二磷酸葡糖和积雪草酸进行混合，进行UGT糖苷转移酶催化积雪草酸糖基化的体外实验；并通过液相质谱联用（UPLC-QTOF/MS）对积雪草酸是否被糖基化进行检测。结果显示2个候选酶中仅一个酶能够催化积雪草酸糖基化。真的很幸运，作者成功锁定了这个UGT酶。

文章叙述到这你以为就结束了吗？没有，作者还想进一步精确地确认糖基化发生在积雪草酸C环的哪个位置，不过碍于样品稀少，核磁共振（NMR）实验未能实行，实属遗憾！

不过最后的小遗憾并不妨碍我们从整体思路去把握这篇文章，该文章切入点很细致，只关注代谢通路上的一个催化反应；做转录组的目的更是直接，就是要找UGT的候选序列；作者后续引入的一系列实验，每个实验的指向也都很精准，很值得我们学习借鉴。

我们都在说转录组文章越来越难发，也都承认转录组也会越来越普遍，更都在谈转录组只是整个实验中的一小部分，那么转录组之后又该辅以哪些实验呢？我想读完此文您应该会有所启发；当然，一篇文章不会适用于所有实验，我们今后也会分享更多类似的文章，供您学习试验参考之用！

下一期，小编将继续分享该转录组产生的第二篇SCI，欢迎您持续关注！

参考文献：Characterization of the Asiatic Acid Glucosyltransferase, UGT73AH1, Involved in Asiaticoside Biosynthesis in Centella asiatica(L.) Urban. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2630   

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