上一期给大家介绍了一篇如何鉴定嫁接中长距离运输mRNA的方法：嫁接中长距离运输的mRNA是如何鉴定的？今天给大家介绍已经发表的第2种鉴定长距离运输的mRNA的方法，两者方法类似，但也各有不同，该方法引入了SNP用以排除假阳性reads。今天着重介绍下大家都非常关心的实验设计以及分析思路。

文章简介

该篇文章是中国农业大学高丽红教授在International Journal of Molecular Sciences杂志发表题为“Identification of Long-Distance Transmissible mRNA between Scion and Rootstock in Cucurbit Seedling Heterografts”的研究论文，该文章也是通过重测序矫正基因组与转录组reads比对方式相结合去除假阳性来鉴定黄瓜-南瓜嫁接体中mRNA 的长距离运输。

实验设计

嫁接组合设置：作者共设四个嫁接组合，如下图，同源嫁接2个：黄瓜Csa/黄瓜Csa，南瓜Cmo/南瓜Cmo；异源嫁接2个：黄瓜Csa/南瓜Cmo，南瓜Cmo/黄瓜Csa。

取样：1. 分别取南瓜和黄瓜的叶片和根，混合提取DNA，用于重测序建库测序。2. 每嫁接组合，9株植株作为一个生物学重复，共3个生物学重复，均取接穗的第一子叶（包括叶柄）以及砧木的根混合提取总RNA，分别用于转录组测序。

分析思路

1. 基因组重建：由于作者所有黄瓜和南瓜材料与参考基因对应材料之间存在差异，所以作者利用重测序数据（120x）替换原参考基因上的SNP、Indel等变异信息，重新构建优化了基因组。
   

2. 转运mRNA识别：如下图，以南瓜接穗黄瓜砧木为列，识别有接穗南瓜向下运输至黄瓜砧木的mRNA，分析过程较为复杂，我们分条来说：

（1）首先用黄瓜砧木根的转录组数据和重建的黄瓜参考基因进行比对，取未必对上的reads再与重建后的南瓜基因组进行比对，比对上的reads用于后续分析；

（2）取步骤1中比对到南瓜基因上的reads再与来自于黄瓜同源嫁接接穗和根转录组合并而来的reads进行blastn比对，不完美匹配的reads（至少存在2个及以上SNP）再次和重建后的南瓜基因组进行比对，比对上的reads用于后续分析；

（3）经过以上多次比对，在步骤2中的再次和南瓜基因组匹配的reads被认为是来自于接穗南瓜向下转运的mRNA，最后再将这些reads与南瓜CDS序列进行blast比对得到转运mRNA基因ID。

两种方法比较

综合来看，两种方法思路类似，但也各有千秋，在基因组重建过程中，第一篇方法中多了物种特异基因组装过程这一步，而本篇文章在RNA数据比对时引入SNP概念也是一种方法创新。

经常遇到小伙伴问：哪种方法更好呢？我想两种方法取其优点结合一下才更好，有对此类长距离运输信使分子鉴定感兴趣的小伙伴欢迎添加微信：llcheng1314 咨询。

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